Name: Het bijhouden van cellen in GFP-transgene zebravis Met behulp van de photoconvertible PSmOrange System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Leer celtracking in GFP-transgene zebravis met het fotoconverteerbare PSmOrange-systeem. Deze methode maakt in vivo monitoring van celherkomst mogelijk tijdens embryonale ontwikkeling en ziekteprocessen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken O. Subach voor het verstrekken van het originele H2B-PSmOrange-plasmide en ons visfaciliteitsteam voor de verzorging van vissen. We zijn dankbaar aan het Nikon Imaging Center aan de Universiteit van Heidelberg voor toegang tot microscopie-apparatuur en analysesoftware. We erkennen de ondersteuning van de Core Facility Live Cell Imaging Mannheim bij de CBTM (DFG INST 91027/10-1 FUGG). Dit werk werd ondersteund door het Excellenzcluster CellNetworks, EcTop Spatio-temporelle coördinatie van signaalprocessen (EcTop 2), Universiteit van Heidelberg aan C.A.B. en de Medische Faculteit Mannheim van de Universiteit Heidelberg en de DFG (FOR 1036/2, 298/3-1 en 298/6-1) aan M.C.

1. H2B-PSmOrange mRNA in vitro transcriptie en mRNA Purification <ol><li> Lineariseren de H2B-PSmOrange bevattende pCS2 + plasmide met de NotI restrictie-enzym volgens instructies van de fabrikant. Opmerking: Voer de volgende stappen met behulp van passende bescherming, zoals handschoenen en een laboratoriumjas aan mRNA vervuiling en degradatie te voorkomen. </li><li> Zuiver het DNA gelineariseerd met behulp van een PCR Purification kit of fenol-chloroform gebaseerde methoden volgens de protocollen van de fabrikant. </li><li> Met 1 ug gelineariseerd template DNA voor Sp6-mRNA transcriptie volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Verwijderen DNA door het toevoegen van 1,0 U RNase-vrije DNaseI gedurende 10-20 min bij 37 ° C. </li><li> Schoonmaken van het mRNA met behulp van een RNA opruimen kit volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> MRNA zuiverheid en concentratie te verhogen, het mRNA precipiteren door toevoeging van 6 pl natriumacetaat (3,0 M, pH 5,2) en 150 pl 96% ethanol. Incubeer de mEMENGDE oplossing bij -20 ° C gedurende ten minste 30 min en tot 24 uur. </li><li> Verzamel de mRNA door het draaien van de oplossing bij 18,407 g gedurende 45 min bij 4 ° C. Gooi de vloeistof en resuspendeer de mRNA in 150 pl 70% ethanol. Meng en centrifugeer de oplossing gedurende nog 15 min bij 4 ° C. Gooi de vloeistof, droog de pellet gedurende 5 minuten op ijs en resuspendeer de mRNA in 20 ul ultrapuur RNase vrij water. </li><li> Beoordeel de concentratie en zuiverheid van het mRNA door fotometrische meting van een 1: 100 verdunning mRNA (1 pl mRNA in 99 ui RNase vrij ultrazuiver water). </li><li> Voor de korte termijn opslag, houd de mRNA-oplossing bij -20 ° C. Voor de lange termijn opslag, houd de mRNA bij -80 ° C. </li></ol> 2. H2B-PSmOrange mRNA micro-injectie in zebravis embryo&#39;s <ol><li> Het opzetten van paring paren de avond voor injectie met behulp van tg (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) dubbele transgene vis (of een andere GFP transgene vis). Laat vis gescheiden door een spacertussen het tijdstip van paring controleren. </li><li> Verwijder de afstandhouder in de ochtend van injectie en laat de vis partner voor 20 min. </li><li> Tijdens de paartijd, verdunnen de H2B-PSmOrange mRNA om de uiteindelijke concentratie van 130 pg / nl (in RNase gratis water) en de overdracht 6 pl injectie oplossing in een micro-injectie capillair met behulp van een microloader tip. Controleer de injectie volume met een gekalibreerde glasplaatje. Stel de inspuitdruk tot 2 nl mRNA-oplossing (260 pg) geïnjecteerd. </li><li> Verzamel de eieren in een gesteriliseerde plastic petri-schaaltje met 1x Embryo (E3) medium. </li><li> Transfer 20 tot 30 embryo&#39;s om een ​​injectie schotel met een kunststof pasteurpipet. </li><li> Injecteer 2 nl mRNA bevattende oplossing in de cel of net onder de cel in de dooier op één-cellig stadium 11. </li><li> Transfer geïnjecteerde embryo&#39;s in een petri-schaaltje met 1x E3 medium, verwijderen of onbevruchte niet normaal ontwikkelende embryo en ze groeien bij 28 ° C. Opmerking: Lichte bescherming of het embryo niet vereist gedurende het experiment. </li><li> Verhogen zebravis embryo 1x E3 en na nog gastrulatie voeg 0,2 mM PTU (1-fenyl-2 thioureum) pigmentatie remmen. Verander het medium tweemaal per dag om het gevaar van bacteriële verontreinigingen te minimaliseren. </li></ol> 3. Embryo Embedding <ol><li> Selecteer het GFP (groen) en PSmOrange (oranje / rood) co-expressie embryo met een binoculaire microscoop uitgerust met een fluorescentielamp en passende emissiefilters. Breng de positieve embryo&#39;s in een steriele petri-schaaltje met 1x E3 medium. </li><li> Dechorionate embryo&#39;s onder een stereomicroscoop behulp van een tang 12. </li><li> Transfer één embryo in een 1,5 ml buisje met 1,0 ml voorverwarmde 1,0% laag smeltpunt agarose (LMA) in ultrapuur water bereid door het gebruik van een cut-tip pipet (P200). Opmerking: Verwarm de LMA tot 80 ° C en afkoelen gedurende 3-5 minuten bij kamertemperatuur vóór inbedding het embryo. </li><li> Breng de embryo in 150 pl in een LMAchambered dekglaasje uit en richt het embryo, bijvoorbeeld dorsale zijde in de beschreven voor de omgekeerde confocale laser scanning microscoop A1R + (of elk ander geschikt microscoop) experiment met een fijne plastic tip. Als de LMA is gepolymeriseerde, vult de kamer met vis water dat 0,2 mM PTU en 0,02% ethyl-3-aminobenzoaat methaansulfonaat (tricaïne) voor anesthesie. </li><li> Voor de beeldvorming van het monster, 15 min wachten om het effect van tricaïne bepalen. De verdoving voorkomt embryo bewegingen die kunnen worden geanalyseerd met een stereomicroscoop uitgerust met helderveld belichting. Let op: De kamers kan twee keer worden hergebruikt. </li></ol> 4. PSmOrange Photoconversion <ol><li> Leg het monster onder de confocale microscoop en scan de specimen om het gebied te identificeren photoconvert behulp van 488 nm en 561 nm lasers voor respectievelijk beeldvorming GFP en PSmOrange. Opmerking: Gebruik de omgekeerde confocale laser scanning microscoop A1R + op de omgekeerde stage TiEcontrolled de microscoop beeldverwerkingssoftware en met 488 nm, 561 nm en 640 nm lasers voor photoconversion en beeldvorming. De toepassing wordt zeker niet zolang de laserlijnen voor conversie en beeldvorming zijn beperkt tot deze microscoop. <ol><li> Zet de doelstelling 20X lucht in plaats (NA: 0,75; WD: 1,0 mm; FOV: 0,64 x 0,64 mm). </li><li> Gebruik de volgende microscoop instellingen om de PSmOrange eiwit te ontdekken voordat photoconversion: 561 nm laser, 0,74 mW gemeten aan de focus vliegtuig boven de doelstelling. Opmerking: Dit komt overeen met 40% op dit systeem (meting in de focus vliegtuig is de enige manier om het effectieve vermogen bepalen). Stel het laservermogen volgens experimentele behoefte de efficiëntie van H2B-PSmOrange injecties kunnen variëren. </li><li> Voeg zoom factoren om het gebied van belang te benadrukken. Hogere vergrotingen verminderen beeldacquisitie tijd en dus fototoxiciteit. </li></ol></li><li> Het verwerven van een z-stack die de structuurs van belang met behulp van 488 nm en 561 nm lasers in de sequentiële modus (line modus 1-&gt; 4). Bevestig de z-stap tussen 1,0 en 2,0 um. Gemiddelde ruwheid en scanfrequentie kan worden gebruikt om de beeldkwaliteit te optimaliseren. </li><li> Scan de monster en selecteer de regio van belang (ROI) tool om het gebied te photoconvert markeren. Bevestig de ROI als stimulatie omgeving. Selecteer de foto Activering / Bleaching module, activeert de 488 nm laser door het controleren van de respectieve en stel de 488 nm laser 80% (1 mW laservermogen gemeten op de doelstelling). Stel de scansnelheid tot 0,5 sec / Frame. </li><li> Open het photoconversion hulpprogramma (ND Stimulation) en geef de photoconversion instellingen. <ol><li> Klik op het commando &quot;Add&quot; om de photoconversion protocol op te geven. </li><li> Stel &quot;Phase&quot; 1 in het menu &quot;Acquisition / Stimulation&quot; naar &quot;Acquisition&quot; en geven het aantal beelden voordat photoconversion in het menu &quot;Loops&quot; te verwerven. </li><li> Set &quot;Fase&quot; 2 &quot;Stimulation &quot;en voer het nummer van de stimulatie events uit te voeren. </li><li> Adjust &quot;Phase&quot; 3 zoals beschreven voor &quot;Fase&quot; 1. Optioneel, plaatst u een wachttijd &quot;Phase&quot; na &quot;Phase&quot; 2 Door de tijd om te wachten voor de laatste ronde van het beeld acquisitie te voeren. </li><li> Zodra alle parameters zijn ingesteld, gelden de stimulatie-instelling en voer het photoconversion. Let op: Laser macht, de frequentie van het scannen en het aantal iteraties voor elke ronde van photoconversion kunnen variëren en verschillen van embryo tot embryo. Een instelling beginnen wordt weergegeven in tabel 1. </li></ol></li><li> Het verwerven van een laatste z-stack met behulp van 488 nm, 561 nm en 640 nm lasers toepassen van de instellingen als hierboven. Stel de 640 nm laser om de geconverteerde PSmOrange met behulp van hoge laservermogen visualiseren (tot 4,5 mW). </li></ol> 5. Demonteer Embryo van LMA <ol><li> Verwijder de embryo bevattende kamer van de microscoop. Verwijder het embryo voorzichtig uit de agarose uzingen tang. </li><li> Breng de embryo in een nieuw gesteriliseerde plastic petrischaal of in een gesteriliseerde 6-well-plaat met 1x E3 en 0,2 mM PTU. Incubeer de embryo bij 28 ° C totdat de gewenste ontwikkelingsstadium. </li></ol> 6. Het analyseren van het lot van photoconverted PSmOrange eiwit tot expressie brengen <ol><li> Re-insluiten het embryo, zoals beschreven in de punten 3.3 en 3.4. </li><li> Leg het monster onder de confocale microscoop en scan de specimen photoconverted cellen (640 nm) in de GFP transgene structuur van belang (488 nm) te identificeren. </li><li> Het verwerven van een z-stack die de structuren van belang met behulp van 488 nm, 561 nm en 640 nm lasers in de sequentiële modus (line modus 1-&gt; 4). Bevestig de z-stap tussen 1,0 en 2,0 um. Gemiddelde ruwheid en scanfrequentie kan worden gebruikt om de beeldkwaliteit te optimaliseren. </li><li> Gebruik een van de volgende methoden om cellen te identificeren, die co-express GFP en de photoconverted eiwit. <ol><li> automatische Custom made Fiji AfbeeldingJ Macro 3 <ol><li> Convolve de oorspronkelijke stack met behulp van de &quot;GaussianBlur&quot; plugin (→ Proces → Filters → GaussianBlur) en trek de soepele stapels van het origineel met behulp van de &quot;Image Calculator&quot; plugin (→ Proces → Image Calculator). Met deze stap om de structuren van belang te visualiseren en vermindering van de berekeningstijd voor de analyse. </li><li> Solliciteer specifieke drempels om de groene en ver-rode kanalen met het oog op de photoconverted cellen te markeren (→ Beeld → Aanpassen → Threshold). Gebruik de &quot;Analyseer Deeltjes&quot; tool om de drempel op te sporen met een geschikte instelling (→ analyseren → Analyseer Deeltjes). </li><li> Open het &quot;Beeld Calculator&quot; plugin en de overlappende ROI in de groene en ver-rode kanaal weer te geven in het geel (→ Proces → Image Calculator). </li></ol></li><li> Microscoop imaging software voor 3D-data evaluatie <ol><li> Geef de stapel3D met behulp van de weergave optie toon volume (→ 3D-visualisatie Menu → Show Volume View). Gebruik de grafische interface om de groene, rode en ver-rode kanalen te selecteren, de helderheid en het contrast aan te passen en snijden de 3D-stack naar het photoconverted gebied (figuur 1) te markeren. Let op: Vergelijkbare methodes voor het analyseren van de gegevens beschikbaar zijn in de meeste van de gemeenschappelijke software voor beeldanalyse. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Tracking+Using+Photoconvertible+Proteins+During+Zebrafish+Development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development.</a> J. Vis. Exp. (4350), (2012).</li>
<li>Subach, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoswitchable+orange-to-far-red+fluorescent+protein%2C+PSmOrange%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A photoswitchable orange-to-far-red fluorescent protein, PSmOrange.</a> Nature Methods. 8, 771-777 (2011).</li>
<li>Beretta, C. A., Dross, N., Bankhead, P., Carl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ventral+habenulae+of+zebrafish+develop+in+prosomere+2+dependent+on+Tcf7l2+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">The ventral habenulae of zebrafish develop in prosomere 2 dependent on Tcf7l2 function.</a> Neural Development. 8, 19(2013).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12651-12656 (2002).</li>
<li>Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mKikGR%2C+a+monomeric+photoswitchable+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein.</a> PLoS One. 3, e3944(2008).</li>
<li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nature Methods. 6, 131-133 (2009).</li>
<li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2+and+Dendra2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2.</a> Nature Protocols. 2, 2024-2032 (2007).</li>
<li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nature Methods. 6, 153-159 (2009).</li>
<li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science. 297, 1873-1877 (2002).</li>
<li>Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+monomeric+photoactivatable+red+fluorescent+protein+for+two-color+super-resolution+sptPALM+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells.</a> J Am Chem Soc. 132, 6481-6491 (2010).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5150/zebrafish-breeding-and-embryo-handling ">http://www.jove.com/science-education/5150/zebrafish-breeding-and-embryo-handling </a> (2015).</li>
<li>Concha, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+tissue+interactions+across+the+dorsal+midline+of+the+forebrain+establish+CNS+laterality%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Local tissue interactions across the dorsal midline of the forebrain establish CNS laterality.</a> Neuron. 39, 423-438 (2003).</li>
<li>Auer, T. O., Duroure, K., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+conversion+of+eGFP-+into+Gal4-transgenic+lines+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated conversion of eGFP- into Gal4-transgenic lines in zebrafish.</a> Nature Protocols. 9, 2823-2840 (2014).</li>
<li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FCas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome Research. 24, 142-153 (2014).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322, 1065-1069 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Transgene embryo&#39;s met TL-reporters hebben fundamenteel bijgedragen aan de embryonale ontwikkeling te begrijpen. Er is echter nog een essentiële noodzaak tot promoters de specifieke visualisatie van bepaalde structuren te vergemakkelijken. In hun afwezigheid, onderzoekers vertrouwen op technieken zoals de photoconversion van fluorescerende eiwitten te weten te komen over het ontstaan ​​en de ontwikkeling van hun structuur van belang. Hierdoor is een essentiële voorwaarde om de moleculaire mechanismen die betrokken z...

Exponentieel verbeterde beeldvormingstechnieken maken het mogelijk om ontwikkelingsprocessen te volgen over perioden van maximaal ongeveer vier opeenvolgende dagen3. Bij zebravis en vele andere dierlijke modelsystemen worden specifieke cellen, weefsels, axonale of vasculaire structuren gemarkeerd door transgene groene of soms rode of gele fluorescente eiwitten om visualisatie te vergemakkelijken. In de meeste transgene lijnen wordt het transgeen echter niet specifiek tot expressie gebracht in de cellen van belang, maar ook in aanvullende structuren, wat het nauwkeurige volgen van bijvoorbeeld enkele cellen of groepen cellen belemmert.
Fluorescente fotoconverteerbare eiwitten zijn goed geschikt voor celtracking tijdens embryonale ontwikkeling. De voorwaarden voor het gebruik van dergelijke eiwitten zijn een langdurige aard, een goed gescheiden emissiebereik na conversie en heldere fluorescentie. Beschikbare fotoconverteerbare eiwitten omvatten die welke hun emissiebereik veranderen na conversie, zoals Kaede4, KiGR5, mEos26, PS-CFP2 of Dendra27 en andere die alleen fluorescent zijn wanneer ze fotogeactiveerd zijn (PAmCherry8, PAGFP9 of PATagRFP10). Hun toepassingen om cellen in bestaande FP-transgene dieren te volgen, zijn echter beperkt omdat ze vaak een groen fluorescente toestand omvatten of niet aan alle bovenstaande criteria voldoen. Pas onlangs rapporteerden Subach en collega's het PSmOrange-eiwit, dat zijn emissie verandert van oranje/rood naar verre rood bij fotoconversie en met succes werd toegepast in cellen in cultuur en gekweekte cellen geïnjecteerd in muizen2.
Om de geschiktheid van het eiwit voor celtracking in een levend embryo te onderzoeken, hebben we een expressieconstruct gemaakt voor de micro-injectie van nucleair-gelabelde H2B-PSmOrange in zebravis-embryo's. We vinden dat het eiwit voldoet aan alle voorwaarden voor succesvolle celtracking in GFP-transgene achtergronden tijdens de eerste 4 (en mogelijk meer) dagen van zebravis embryonale ontwikkeling. Gedurende deze tijd zijn de meeste van de celmigratiegebeurtenissen bij vissen voltooid, waardoor het PSmOrange-systeem een uitstekende aanvulling is op de zebravis-toolkit.

<table><tbody><tr><td>PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MiniElute Cleanup kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Pasteur</td><td>alpha laboratories</td><td>LW4000</td><td></td></tr><tr><td>Original H2B-PSmOrange Plasmid</td><td>Addgene</td><td>31920</td><td>Het in het artikel beschreven plasmide is beschikbaar in het Carl lab</td></tr><tr><td>FemtoJet Microinjector</td><td>Eppendorf</td><td>5247 000.013</td><td></td></tr><tr><td>Forceps (5 Inox)</td><td>NeoLab</td><td>2-1633</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System&nbsp;</td><td>Nunc</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R+</td><td>Nikon GmbH Germany</td><td>Geen nummer</td><td></td></tr><tr><td>Nikon PLAN Apo &lambda; 20X air objective&nbsp;</td><td>Nikon GmbH Germany</td><td>Geen nummer</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements AR Software (v. 4.30.02)</td><td>Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging</td><td>Geen nummer</td><td></td></tr></tbody></table>

het bijhouden van cellen in gfp-transgene zebravis met behulp van de photoconvertible psmorange system

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

De snelle ontwikkeling van transparante zebravis embryo's (Danio rerio) in combinatie met fluorescente labels van cellen en weefsels maakt het mogelijk om ontwikkelingsprocessen te visualiseren terwijl ze plaatsvinden in het levende dier. Cellen van belang kunnen worden gelabeld door gebruik te maken van een weefselspecifiek promotor om de expressie van een fluorescente proteïne (FP) aan te drijven voor het genereren van transgene lijnen. Het gebruik van fluorescente fotoconveerbare proteïnen voor dit doel maakt het bovendien mogelijk om gedefinieerde structuren binnen het expressiedomein nauwkeurig te volgen. Het verlichten van de proteïne in het gebied van belang verandert het emissiespectrum en markeert een specifieke cel of celcluster waardoor andere transgene cellen in hun oorspronkelijke kleur achterblijven. Een belangrijke beperking is het ontbreken van bekende promotoren voor een groot aantal weefsels in de zebravis. Omgekeerd hebben gen- en enhancer trap screens enorme transgene bronnen gegenereerd die letterlijk alle embryonale structuren discreet labelen, meestal met GFP of in mindere mate met rode of gele FP's. Een aanpak om gedefinieerde structuren in dergelijke transgene achtergronden te volgen, zou zijn om bovendien een ubiekwit fotoconveerbare proteïne te introduceren, die in de cel(len) van belang kan worden geconverteerd. De fotoconveerbare proteïnen die beschikbaar zijn, hebben echter een groene en/of minder vaak een rode emissietoestand1 en kunnen daarom vaak niet worden gebruikt om cellen in de FP-achtergrond van bestaande transgene lijnen te volgen. Om dit probleem te omzeilen, hebben we het PSmOrange-systeem voor de zebravis2,3 ontwikkeld. Eenvoudige micro-injectie van synthetisch mRNA dat codeert voor een nucleaire vorm van dit proteïne labelt alle celkernen met oranje/rode fluorescentie. Na gerichte fotoconversie van het proteïne, verandert het zijn emissiespectrum naar verrood. De kwantumefficiëntie en stabiliteit van het proteïne maken PSmOrange tot een uitstekend celvolgsysteem voor zebravissen en mogelijk andere teleost soorten.

Figuur 1 illustreert een voorbeeld van het PSmOrange photoconversion systeem. De pijnappelklier complex is een geconserveerde structuur in de gewervelde dorsale diencephalon. Zoals in vele andere gewervelde dieren, complex, bestaande uit de pijnappelklier orgel in het midden van het diencephalon en linkszijdige parapineal cellen. Elegant, maar tijdrovende uncaging experimenten toonden aan dat parapineal cellen ontstaan ​​in het voorste deel van de pijnappelklier orgel <s...

We hebben het fotoomzetbare PSmOrange-systeem geïntroduceerd als een krachtig, eenvoudig en kosteneffectief hulpmiddel voor in vivo celtracking in GFP transgene achtergrond. Dit protocol beschrijft de toepassing ervan in het zebravis modelsysteem.

Het bijhouden van cellen in GFP-transgene zebravis Met behulp van de photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Het algemene doel van de PSmOrange fotoconversietechnologie is om cellen in het levende dier te volgen tijdens de embryonale ontwikkeling en ziekte. Deze methode kan antwoord bieden op kernvragen in de ontwikkelingsbiologie, zoals het ontrafelen van de oorsprong van cellen die uitgroeien tot weefsels en organen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden toegepast in GFP-transgene achtergronden.Deze methode kan ook worden toegepast in verschillende onderzoeksgebieden, zoals regeneratie, tumorprogressie en invasie. Nadat de PSmOrange- en GFP-expresserende embryo's zijn gegenereerd en ingebed volgens het tekstprotocol, wordt het embryo onder de confocale microscoop geplaatst. Gebruik het 20x luchtobjectief en de 488 en 561 nanometer lasers om het preparaat te scannen en een gebied te identificeren voor fotoconversie. Om het PSmOrange-eiwit vóór fotoconversie te detecteren, wordt de 561 nanometer laser gebruikt bij een vermogen van 0,74 milliwatt, gemeten in het brandvlak boven het objectief; pas het laservermogen indien nodig aan.Pas de zoomfactoren aan om het gebied van interesse te accentueren en de beeldacquisitietijd en fototoxiciteit te verminderen. Neem een Z-stack op die de structuren van interesse beslaat, gebruikmakend van de 488 en 561 nanometer lasers in sequentiële modus en een Z-stap tussen 1,0 en 2,0 micrometer. Pas het lijnsgemiddelde en de scanfrequentie aan om de beeldkwaliteit te optimaliseren.Scan vervolgens het monster en selecteer de tool voor het gebied van interesse, of ROI-tool, om het gebied te markeren dat moet worden gefotoconverteerd voordat u de ROI vaststelt als het stimulatiegebied. Selecteer de module voor fotoactivatie-bleking, vink het vakje aan om de 488 nanometer laser te activeren, en stel de 488 nanometer laser vervolgens in op 80% en de scansnelheid op 0,5 seconden per frame. Open daarna de utility voor fotoconversie en klik op 'Add' om het fotoconversieprotocol te specificeren.Stel in het menu voor acquisitiestimulatie Fase Eén in op acquisitie en geef in het menu voor lussen het aantal beelden aan dat moet worden vastgelegd vóór de fotoconversie. Stel Fase Twee in op stimulatie en voer het aantal te utführen stimulatiegebeurtenissen in. Pas Fase Drie aan zoals beschreven voor Fase Eén.Voeg optioneel een wachtfase toe na fase twee door de wachttijd vóór de laatste ronde van beeldacquisitie in te voeren. Zodra de parameters zijn ingesteld, past u de stimuleringsinstelling toe en voert u de fotoconversie uit. Microscopische instellingen zijn cruciaal voor PSmOrange-fotoconversie.Om een succesvolle photoconversie te garanderen, wordt het embryo direct na het experiment afgebeeld om het photoconverteerde PSmOrange-eiwit te detecteren. Als de conversie niet succesvol was, wordt de procedure herhaald. Neem met gebruik van de 488, 561 en 640 nanometer lasers, en door de 640 nanometer laser in te stellen op een hoog vermogen, tot 4,5 milliwatt, een laatste z-stack op met de zojuist beschreven instellingen.Om het embryo te verwijderen, haalt u de kamer uit de microscoop en gebruikt u een pincet om het embryo uit de agarose te halen. Verplaats het embryo naar een nieuwe gesteriliseerde plastic petrischaal, of een gesteriliseerde 6-wells plaat, met 0,2 millimolaire PTU in E3. Incubeer het embryo bij 28 graden Celsius tot het gewenste ontwikkelingsstadium. Om het lot van de cellen die photoconverteerde PSmOrange-proteïnen tot expressie brengen te analyseren, bed laagt u het embryo opnieuw in volgens het tekstprotocol.Scan het preparaat onder de confocale microscoop om gefotoconverteerde cellen te identificeren in de GFP-transgene structuur van belang. Gebruik de 488, 561 en 640 nanometer lasers om een z-stack te verkrijgen met een vaste stapgrootte van 1 tot 2 micrometers in sequentiële modus die de structuren beslaat. Identificeer met Image J Fiji-software de cellen die zowel GFP als het gefotoconverteerde eiwit co-expresseren.Dupliceer de oorspronkelijke stapel, gebruik de Gaussian Blur-plugin en de image calculator om de gladgestreken stapels van de oorspronkelijke stapels af te trekken. Pas specifieke drempelwaarden toe op de groene en verre-rode kanalen om de gefotoconverteerde cellen te markeren. Gebruik vervolgens de Analyze Particles-tool met een geschikte instelling om de drempelgebieden in het groene kanaal te detecteren.Herhaal deze stap voor het ver-roodkanaal. Open de plugin van de beeldcalculator om de co-lokaliserende cellen te detecteren. Toon de overlappende ROI's in het groen- of het ver-roodkanaal in geel met behulp van de Analyze Particles-tool.Voer met behulp van de NIS-Elements software een 3D-data-evaluatie uit en toon de stack in 3D met de optie Show Volume View. Gebruik vervolgens de grafische interface om de groene, rode en ver-rode kanalen te selecteren, pas de helderheid en het contrast aan en crop de 3D-stack om het fotoconverteerde gebied te accentueren. Hier wordt een voorbeeld getoond van het PSmOrange fotoconversiesysteem in transgene FOXD3 floating head GFP-embryo's van zebravis.Op 26 uur na bevruchting werden twee celclusters in het anterieure deel van de pijnappelklier gefotoconverteerd en onmiddellijk afgebeeld. Het eiwit werd gedetecteerd met een 640 nanometer ver-rood laser, maar niet met een 561 nanometer laser. In deze cellen was de GFP-expressie aanvankelijk verminderd als gevolg van fotobleking.Bij 52 HPF werden GFP en H2B PSmOrange gedetecteerd in de cellen die het gefotoconverteerde H2B PSmOrange-eiwit tot expressie brachten. Een klein aantal van deze cellen vormde de parapineaal aan de linkerzijde van de hersenen. Dit resultaat is consistent met eerdere rapporten over de oorsprong van parapineaalcellen in de anterieure pineaal en toont de toepasbaarheid van de PSmOrange-techniek aan in het levende GFP-transgene gewervelde embryo.Na deze procedure kan de celtrackingsanalyse worden uitgevoerd in genetisch gemanipuleerde embryo's om aanvullende vragen te beantwoorden over de moleculaire hiërarchieën die ten grondslag liggen aan de celontwikkeling.

tracking-cells-gfp-transgenic-zebrafish-using-photoconvertible

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Multifoton microscopie maakt de controle van een lage energetische fotonen met diepe penetratie optische en minder fototoxiciteit. We beschrijven het gebruik van deze technologie voor live cell etikettering in zebravis embryo's. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor foto-inductie van diverse licht-responsieve moleculen.

Twee-foton-Based Fotoactivatie in de Live zebravis embryo&#39;s

Dit protocol beschrijft een algemene aanpak voor photoconversion van fluorescerende eiwitten te voeren op een confocale laser scanning microscoop. We beschrijven de procedures voor de photoconversion van puried eiwit monsters, evenals voor dual-probe optische markeren in levende cellen met mOrange2 en Dronpa.

Photoconversion van gezuiverde fluorescerende eiwitten en dual-probe optische markering in levende cellen

In deze video worden de technieken voor multicolor confocale time-lapse imaging en gerichte cel ablatie verstrekt. Time-lapse imaging wordt gebruikt om het gedrag van meerdere celtypen van belang te...

Multicolor Time-lapse imaging van transgene zebravis: Visualizing netvlies Stem Cells geactiveerd door middel van gerichte neuronale cellen Ablation

Een methode wordt beschreven om enkele cellen met een gekooide fluorescerend eiwit met behulp van twee-foton absorptie van een Ti photoactivate: Sapphire femtoseconde laser oscillator. Het lot kaart brengen van de gefotoactiveerd cel, wordt immunohistochemie gebruikt. Deze techniek kan worden toegepast op elk celtype.

Single Cell Fate Mapping in de zebravis

Hier presenteren we een methode voor het foto-geactiveerd schakelen van photoconverteerbare fluorescerende eiwitten (PCFPs) in het levende zebravisembryo en het verdere volgen van het photoconverteerde eiwit op specifieke tijdstippen tijdens de ontwikkeling. Deze methodologie maakt het mogelijk om celbiologische gebeurtenissen te monitoren die ten grondslag liggen aan verschillende ontwikkelingsprocessen in een levend gewerveld organisme.

Mobiele Tracking Met behulp van Photoconvertible eiwitten tijdens ontwikkeling van de zebravis

This video demonstrates the tracking of leukocyte recruitment using transgenic zebrafish larvae expressing photoconvertible green fluorescent protein. Pre-injecting red fluorescent dye-labeled bacteria into the otic vesicle and inducing photoconversion enables observation of leukocytes' migration, phagocytosis, and dispersal throughout the body, providing valuable insights into immune response dynamics.

Photoconversion-Based Leukocyte Tracking in Bacterial-Infected Transgenic Zebrafish

Somitogenesis is een ritmische ontwikkelingsproces dat ruimtelijk patronen het lichaam as van gewervelde embryo's. Eerder ontwikkelden we transgene zebravis lijnen die fluorescerende verslaggevers gebruiken om de cyclische genen die dit proces sturen observeren. Hier hebben we cultuur verspreid cellen van deze lijnen en het imago van hun oscillaties in de tijd in vitro.

Generatie Dispersed presomitische Mesoderm Cell Cultures for Imaging van de zebravis Segmentatie Klok in enkele cellen

Hier presenteren we een protocol om te laten zien hoe de photoconversion van de cel wordt bereikt door UV blootstelling aan specifieke gebieden uiten de fluorescente proteïne, Eos, in levende dieren.

Eencellige Photoconversion in levende Intact zebravis

Dit protocol beschrijft een methode voor de photoconversion van Kaede fluorescent proteïne in endocardial cellen van de levende zebrafish embryo waarmee het volgen van endocardial cellen tijdens de atrioventriculaire kanaal en Atrioventriculaire hart ventiel ontwikkeling .

Volgende Endocardial weefsel mutaties via de cel Photoconversion in het Embryo van de zebravis

Presenteren we een efficiënt en gemakkelijk te gebruiken protocol voor het voorbereiden van primaire celculturen van zebravis embryo's voor transfectie en levende cel imaging, evenals een protocol bij het bereiden van primaire cellen van volwassen zebrafish hersenen.

Cultuur en de transfectie van zebravis primaire cellen

Dit protocol beschrijft het gebruik van een genetisch gecodeerd waterstofperoxide (H2O2)-biosensor in gekweekte zebravisneuronen en larven voor het beoordelen van de fysiologische signaleringsrollen van H2O2 tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel. Het kan worden toegepast op verschillende celtypen en worden aangepast met experimentele behandelingen om reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de algemene ontwikkeling te bestuderen.

ROS Live Cell Imaging tijdens neuronale ontwikkeling

Leer celtracking in GFP-transgene zebravis met het fotoconverteerbare PSmOrange-systeem. Deze methode maakt in vivo monitoring van celherkomst mogelijk tijdens embryonale ontwikkeling en ziekteprocessen.

Het bijhouden van cellen in GFP-transgene zebravis Met behulp van de photoconvertible PSmOrange System

Meer video's verkennen