Name: Isolatie en profilering van MicroRNA-bevattende exosomes van Human Bile (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Leer een robuuste methode voor exosoomisolatie uit menselijke gal via ERCP voor microRNA-profiling. Deze techniek ondersteunt onderzoek naar biomarkers voor leverziekten en cholangiocarcinomen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door een K08 Award (DK090154-01) van de National Institutes of Health (NIH; aan F.M.S.).

Het verkrijgen van de gal van patiënten met endoscopische retrograde cholangiopancreaticografie (ERCP) behoeft de goedkeuring van een menselijke proefpersonen onderzoeksprotocol door de Institutional Review Board. Al het werk hier wordt gepresenteerd werd goedgekeurd door de Johns Hopkins University Institutional Review Board. 1. exosome Isolatie van Bile <ol><li> Voer endoscopische retrograde cholangiopancreaticografie (ERCP). Plaats de patiënt in rugligging en intuberen. <ol><li> Laat een duodenoscoop door de mond van de patiënt en plaats deze in het tweede deel van de twaalfvingerige darm en identificeren van de belangrijkste papilla. </li><li> Selectief canule de galbuis door het invoegen van een triple lumen sphincterotome voorgeladen met een 0,035 inch (0,9 mm) hydrofiele geleidingsdraad. </li><li> Advance de geleidedraad onder fluoroscopische begeleiding van de lever kanaal links omdat soms moeilijk kan zijn om de cystic kanaal van rechts lever kanaal te differentiëren, dan vooraf desphincterotome 5 cm in de galwegen stevigheid verkrijgen. </li><li> Verwijder de voerdraad, sluit een 10 ml spuit om de geleidedraad doorgang door de luer lock en zuig de gal via 10 ml onderdruk. </li><li> Verwijder de spuit met de gal te gaan met de ERCP door opnieuw inbrengen van de geleidingsdraad en het injecteren van contrastmiddel via de injectiepoort de galboom ondoorzichtig. </li><li> Breng de verzamelde gal in een 15 ml buis op ijs en houden op ijs tot zover om de centrifugatiestap. Let op: Draag handschoenen om jezelf en de monsters te beschermen! Behandel de gal als een mogelijke bron van infectie zoals hepatitis A virus deeltjes kan bevatten! </li><li> Houd het monster (s) op ijs. Ofwel doorgaan met stap 1,2 en centrifugeer bij 500 xg bij 4 ° C gedurende 10 min en vervolgens bevriezen bij -80 ° C tot verder gebruik. Opmerking: De monsters opgeslagen zo al jarenlang routinematig gebruikt met goede resultaten 19. </li></ol&gt; </li><li> Overdracht 400 ul van gal in een microcentrifugebuis en laat cellen en celresten door centrifugatie bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant door pipetteren, overbrengen naar een nieuwe microcentrifugebuis en centrifugeer de monster (s) bij 16.500 xg gedurende 20 min bij een 4 ° C aan het supernatant verdere puin. Gooi de buizen in de biologisch gevaarlijk afval. Als alternatief, draaien de monsters in een ultracentrifuge plaats. </li><li> Verzamel de supernatant en filteren in een bioveiligheid kast met een spuit door een 0,2 micrometer polyethersulfon (PES) membraan filter die een goede debieten en lage eiwit binding aan alle deeltjes die groter zijn dan 200 nm links te verwijderen is. </li><li> Pipet de gefiltreerde supernatant ultracentrifuge buizen en voeg PBS zodat de buizen meer dan 2/3 vol. Als de buizen bevatten minder liquide dan zal de buizen instorten tijdens centrifugeren! Buizen kunnen gewassen geautoclaveerd en meerdere keren hergebruikt. </li><li> Pellet de exosomes met ultracentrifugatie bij 120.000 xg gedurende 70 min bij 4 ° C. Na het centrifugeren blik op de bodem van de ultracentrifuge buis te zien soms kleine gele pellets; Dit zijn de exosomes. </li><li> Verwijder het supernatant door het zorgvuldig decanteren het en desinfecteren het afval door het toevoegen van bleekmiddel tot een uiteindelijke concentratie van 10% v / v en laat het staan ​​voor 20 min. </li><li> Voor downstream experimenten, ofwel verwerken de pellet (s) in een klein volume van de geschikte oplossing (bijvoorbeeld, radio-immunoprecipitatie assay (RIPA) buffer voor isolatie van eiwitten, RNA lysisbuffer voor miR isolatie) of resuspenderen in 50-150 pl fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) die hetzij bij -80 ° C voor toekomstig gebruik (kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qRT-PCR) of eiwitextractie etc.) worden opgeslagen of karakterisering van de exosome voorbereiding door TEM of nanodeeltjes optische analyse . </li></ol> 2. exosome Identificatie doorTransmissie Elektronen Microscopie (TEM) of CryoEM <ol><li> Resuspendeer extracellulaire blaasjes in 100 pl PBS door pipetteren. Gebruik bij voorkeur exosomes die niet bij -20 ° C opgeslagen of -80 ° C, in het bijzonder bij het uitvoeren van de isolatie voor het eerst. </li><li> Adsorberen een 20 ui monster (ongeveer 2 ug) tot 400 mesh met koolstof beklede Parlodion koper roosters gedurende 2 minuten en laten drogen bij kamertemperatuur. </li><li> Bevestig de exosoom in 1% (v / v) glutaaraldehyde (EM-kwaliteit) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur door het plaatsen van druppels voorzichtig op het gedroogde preparaat. </li><li> Was de roosters tweemaal met water gedurende 5 minuten en daarna contrast vlek EV met 1% fosfowolfraamzuur (PTA) gedurende 30 sec. </li><li> Verwerven beelden met een elektronenmicroscoop bij een versnellingsspanning van 80 kilovolt beginnend bij vergrotingen van 20.000 x en oplopend tot 100,000X bij het bepalen van de grootte van de deeltjes. Opmerking: andere bereidingen zoals gelaagdheid op Formvar koolstof beklede 200 mesh koper of nikkel roosters en contrast vlekken like 1% of 2% uranylacetaat gedurende 10-15 min zijn mogelijk. </li><li> Voor CryoEM, meng 20 pl monster (ongeveer 2 ug) met 60 ul Proteïne G goud 10 nm (1: 3 verhouding). Dit zal helpen om de exosome diameter bepalen. </li><li> Breng de monsters op-glow afgevoerd C-flat essen carbon roosters en verwijder overtollige vloeistof door te deppen. Freeze de roosters door ze onmiddellijk dompelen in vloeibare ethaan. </li><li> Monteer de roosters in een cryoholder in vloeibare stikstof. </li><li> Het verwerven van de beelden op 200 kV met vergrotingen van 20.000 x en 100,000X. </li></ol> 3. exosome Identificatie van Multi-parameter nanodeeltjes Optical Analyse <ol><li> Resuspendeer de geïsoleerde exosomes in 100 pl PBS door pipetteren. </li><li> Verdun exosomes in 600 gl PBS bij verschillende verhoudingen (zoals 1:50, 1: 100, 1: 300, 1: 600 en 1: 1200). </li><li> Visualiseer de exosomes door laserlicht verstrooiing met de juiste instrumenten en software in real-time op basis van manufacturer&#39;s protocol 20. </li><li> Verhoging van het niveau van de camera in de opnamestand tot deeltjes zichtbaar worden, pas dan de focus om de deeltjes kijken glad. </li><li> Terwijl in de standaardmodus, verminderen de camera tot het laagste niveau dat de deeltjes nog te zien, indien nodig aan te passen sluiter van de camera en krijgen om dit te bereiken. </li><li> Visueel te controleren om ervoor te zorgen 20-100 deeltjes zichtbaar zijn op het scherm, als het apparaat niet te spoelen en pas de verdunning in PBS. </li><li> Stel vervolgens de vangst duur tussen 30-60 sec. Nadat de beelden worden vastgelegd, stel procesparameters totdat alle deeltjes worden geïdentificeerd op het scherm en het video opnemen. </li></ol> 4. exosome karakterisering door Western Blot <ol><li> Lyse exosoom pellets 2-5 ml van gal in 100 pl ijskoude assay radio-immunoprecipitatie (RIPA) buffer met een proteaseremmer op en neer te pipetteren en grondig mengen lysaten krachtig gedurende 30 secop een vortex om de eiwitten effectief oplosbaar. </li><li> Hoewel meestal niet nodig, puls-sonicatie van de monsters op ijs met 2 pulsen van 10 seconden per volledige lysis te verzekeren. </li><li> Pellet onoplosbare materiaal door centrifugeren bij 15.000 xg bij 4 ° C gedurende 5 minuten en overbrengen supernatant naar een schone buis. </li><li> Bepaal de eiwitconcentratie met een gekozen werkwijze (bijv bicinchoninezuur (BCA), Coomassie, gemodificeerde Lowry, 660 nm Protein Assay, enz.) Volgens het protocol van de fabrikant. De werkwijze is niet zo belangrijk zolang dezelfde methode consistent gebruikt wordt om die te vergelijken over experimenten bereiken. </li><li> Belasting 50 ug eiwit per monster in Laemmli buffer na verwarmen van het monster bij 95 ° C gedurende 5 min in een putje van een polyacrylamidegel voor elektroforese (PAGE). </li><li> Electrophorese de monsters op de PAGE gels 1,5 uur en breng de gescheiden eiwitten op een nylonmembraan. </li><li> Block het membraan (en) met 5% magere melk in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween 20 (TBS-T) gedurende 1 uur, daarna geïncubeerd met exosome-specifieke antilichamen zoals anti-CD63 en anti-TSG-101 bij een verdunning van 1: 500 bij voorkeur O / N bij 4 ° C. </li><li> Was de membranen met TBS-T 3 x 10 min, vervolgens geïncubeerd met een geschikte, bijpassende HRP-geconjugeerd secundair antilichaam in 5% magere melk in TBS-T gedurende 1-2 uur bij KT. </li><li> Was het membraan (s) 3 x 5 min met TBS-T en detecteren van specifieke eiwitten met chemoluminescentie reagens volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Beeld de membranen met film of een digitaal beeldvormingssysteem volgens het protocol van de fabrikant. </li></ol> 5. MicroRNA isolatie van de geïsoleerde exosomes Noot: Isolatie van miRNA van gal exosomes wordt uitgevoerd met een gemodificeerde miRNA isolatie op basis van een commercieel verkrijgbare kit, maar elk ander RNA isolatiewerkwijze kunnen worden gebruikt of aangepast. <ol><li> Voeg 300 &amp;# 181; l lysis / gebouw buffer om de exosome pellet (geïsoleerd uit 400 ul gal), vortex, pipet of passeren van een naald / spuit om de exosomes volledig te lyseren om een ​​homogene lysaat te verkrijgen. </li><li> Voeg 1/10 (30 pi) volume van miRNA Homogenaat Additive, en meng goed door vortexen of het buisje diverse tijd. </li><li> Incubeer het mengsel gedurende 10 min op ijs. </li><li> Voeg een hoeveelheid zuur fenol: chloroform gelijk aan de initiële homogenaat (300 ui). </li><li> Voeg 5 ul van 5 fmol / pl CEL-miR 39 en vortex gedurende 30-60 sec. </li><li> Centrifugeer 5 min bij 10.000 xg bij kamertemperatuur scheiden de waterige (bovenste) en organische (onderste) fase. </li><li> Zorgvuldig aspireren de bovenste fase door pipetteren en overdracht naar een nieuwe buis maar tekent daarbij het volume overgedragen. Gooi de organische fase in de daarvoor bestemde container organisch afval. </li><li> Te verrijken voor kleine RNA voeg 1/3 volume 100% ethanol aan de waterige fase teruggewonnen en meng goed door vortexen of omkeren van de tuverscheidene keren. </li><li> Pipet het lysaat / ethanol mengsel op de filterpatroon tot 700 gl per keer. </li><li> Centrifugeer de patronen voor 15 sec bij maximaal 10.000 xg of toepassen vacuum om het mengsel pass filter. </li><li> Vang filtraat en indien het lysaat / ethanol mengsel dan 700 pl, dragen het doorstroomkanaal een nieuwe buis en herhaal de procedure om alle filtraten verzamelen. Deze filter bevat RNA fracties zonder kleine RNA&#39;s en kunnen worden gebruikt om deze grotere RNAs herstellen. </li><li> Voeg 2/3 volume van RT 100% ethanol aan de totale filtraat en meng goed door vortexen. </li><li> Pipet het filtraat / ethanol mengsel op een tweede filter cartridge. Zoals voor het maximumvolume dat tegelijk kan worden toegepast, is 700 pi. </li><li> Centrifugeer gedurende 15 sec bij 10.000 xg of vacuum toe te passen zoals beschreven in stap 5.10. </li><li> Gooi de doorstroom en herhalen totdat alle filtraat / ethanol mengsel werd gefiltreerd. </li><li> Solliciteer 70081; l miRNA Wash Solution 1 tot en met de filterpatroon, centrifuge voor 5-10 sec of toe te passen vacuüm en gooi de doorstroming. </li><li> Was het filter met 500 pi wasoplossing 2/3 zoals gedaan in stap 5.16. </li><li> Herhaal het wassen een tweede keer met 500 pl wasoplossing 2/3 als in stap 5,16, gooi het doorstroomkanaal en plaats het filter terug in de verzamelbuis. </li><li> Draai de filter cartridge 1 min bij 10.000 xg alle overblijvende vloeistof uit het filter te verwijderen. </li><li> Breng de filterpatroon in een frisse verzamelbuis en 100 pl warm (95 ° C) nuclease vrij water op het midden van het filter. </li><li> Spin de assemblages voor 20-30 sec op maximale snelheid aan het RNA te herstellen. </li><li> Verzamel het eluaat en onmiddellijk te gebruiken of op te slaan bij -80 ° C. </li></ol>

<ol><li>Admyre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+with+immune+modulatory+features+are+present+in+human+breast+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk.</a> J. Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).</li>
<li>Aushev, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparisons+of+microRNA+patterns+in+plasma+before+and+after+tumor+removal+reveal+new+biomarkers+of+lung+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparisons of microRNA patterns in plasma before and after tumor removal reveal new biomarkers of lung squamous cell carcinoma.</a> PLoS One. 8 (10), e78649(2013).</li>
<li>Ben-Dov, I. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+microRNA+as+potential+biomarkers+of+autosomal+dominant+polycystic+kidney+disease+progression%3A+description+of+miRNA+profiles+at+baseline%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Urine microRNA as potential biomarkers of autosomal dominant polycystic kidney disease progression: description of miRNA profiles at baseline.</a> PLoS One. 9 (1), e86856(2014).</li>
<li>Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+current+knowledge+of+their+composition%2C+biological+functions%2C+and+diagnostic+and+therapeutic+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).</li>
<li>Kosaka, N., Iguchi, H., Yoshioka, Y., Takeshita, F., Matsuki, Y., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+mechanisms+and+intercellular+transfer+of+microRNAs+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Secretory mechanisms and intercellular transfer of microRNAs in living cells.</a> J. Biol. Chem. 285 (23), 17442-17452 (2010).</li>
<li>Mittelbrunn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unidirectional+transfer+of+microRNA-loaded+exosomes+from+T+cells+to+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells.</a> Nat. Commun. 2, 282(2011).</li>
<li>Pegtel, D. M., van de Garde, M. D., Middeldorp, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+miRNAs+exploiting+the+endosomal-exosomal+pathway+for+intercellular+cross-talk+and+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Viral miRNAs exploiting the endosomal-exosomal pathway for intercellular cross-talk and immune evasion.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1809 (11-12), 715-721 (2011).</li>
<li>Peinado, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoma+exosomes+educate+bone+marrow+progenitor+cells+toward+a+pro-metastatic+phenotype+through+MET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET.</a> Nat. Med. 18 (6), 883-891 (2012).</li>
<li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nat. Rev. Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).</li>
<li>Valadi, H., Ekstrom, K., Bossios, A., Sjostrand, M., Lee, J. J., Lotvall, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nat. Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).</li>
<li>Bessho, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+identifies+candidate+microRNAs+for+pathogenesis+of+experimental+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics identifies candidate microRNAs for pathogenesis of experimental biliary atresia.</a> BMC Syst. Biol. 7, (2013).</li>
<li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+reveals+distinct+signatures+in+B+cell+chronic+lymphocytic+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (32), 11755-11760 (2004).</li>
<li>Collins, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differential+microRNA+profile+distinguishes+cholangiocarcinoma+from+pancreatic+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg.+Oncol%22%5BJournal%5D)">A differential microRNA profile distinguishes cholangiocarcinoma from pancreatic adenocarcinoma.</a> Ann. Surg. Oncol. 21 (1), 133-138 (2014).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+polycistron+as+a+potential+human+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A microRNA polycistron as a potential human oncogene.</a> Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).</li>
<li>Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+signatures+of+tumor-derived+exosomes+as+diagnostic+biomarkers+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer.</a> Gynecol. Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).</li>
<li>Rabinowits, G., Gercel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+microRNA%3A+a+diagnostic+marker+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer.</a> Clin. Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).</li>
<li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nat.Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).</li>
<li>Lance, R. S., Drake, R. R., Troyer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+recognition+assay+reveals+prostasomes+as+promising+plasma+biomarkers+for+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Anticancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Multiple recognition assay reveals prostasomes as promising plasma biomarkers for prostate cancer.</a> Expert Rev. Anticancer Ther. 11 (9), 1341-1343 (2011).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bile+contains+microRNA-laden+extracellular+vesicles+that+can+be+used+for+cholangiocarcinoma+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human bile contains microRNA-laden extracellular vesicles that can be used for cholangiocarcinoma diagnosis.</a> Hepatology. 60 (3), 896-907 (2014).</li>
<li>Gabriel, D. A., Giordano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticle+sizing+and+counting+using+light+scattering+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Thromb.+Hemost%22%5BJournal%5D)">Microparticle sizing and counting using light scattering methods.</a> Semin. Thromb. Hemost. 36 (8), 824-832 (2010).</li>
<li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+secretion%2C+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 30, 255-289 (2014).</li>
</ol>

Geen van de auteurs heeft concurrerende financiële belangen.

Om op betrouwbare wijze te benutten exosomes geïsoleerd uit gal, is het belangrijk om een ​​constante hoge kwaliteit isolatie methoden gebruiken om de kwaliteit van de monsters een hoog rendement te verkrijgen. De methodologie die in dit document is een gevestigde manier om exosomes en miRNA te isoleren uit humane gal. Het wijst op de volgende essentiële stappen ter karakterisering van de geïsoleerde exosomes dat ten minste elektronenmicroscopie of nanodeeltjes optische analyse en Western blots moeten omvatten. <p c...

Net als andere biologische vloeistoffen, dat wil zeggen, moedermelk, plasma of urine, gal bevat exosomes, lipide rijke blaasjes 1-4. Exosomes kunnen induceren of biologische functies te wijzigen ontvangende cellen 5, 6, een vorm van cel-cel communicatie die hun normale functie 4, 7-9 kan zijn. Exosomes kunnen miRNA soorten die een waardevolle bron van biomarkers voor diagnose 10 bevatten. miRNAs profielen hebben aanzienlijke aandacht gekregen in de afgelopen jaren als diagnostische en prognostische merkers voor verschillende ziekten 11-14. miRNA zelf vindt in biologische vloeistoffen, eventueel vrijgegeven door dode cellen en de hoeveelheid cellen stal kan sterk worden beïnvloed door een onderliggende ziekte. De miRNA profiel van exosomes niet noodzakelijk overeen met de miRNA profiel van de cel uit 6, 10, 15-17, maar exosomes kan miRNA handtekeningen die karakteristiek zijn voor de ouderlijke ce zou kunnen dragenll graag een tumorcel. Tumor afgeleide exosomes geïdentificeerd in het plasma van patiënten met longadenocarcinoom, prostaatkanker en andere tumoren 8, 16, 18. Het doel van deze methode is de betrouwbare en robuuste isolatie van exosomes uit humane gal specimens, grotendeels onafhankelijk van hun procedures voorafgaande behandeling. Het werd ontwikkeld om gal gebruiken als een betrouwbare bron van miRNA voor mogelijke diagnose van ziekten van de galwegen zoals cholangiocarcinoma 19. Het bestaat uit verschillende stappen van centrifugatie bij toenemende snelheden exosomes isoleren en voor andere biologische vloeistoffen kunnen zijn.

<table><tbody><tr><td>0.2 &micro;m Polyethersulfone (PES) membraanfilter</td><td>Corning</td><td>431229</td><td></td></tr><tr><td>thinwall polyallomer ultracentrifuge buizen&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>331374</td><td></td></tr><tr><td>SW40Ti rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LM10-HS&nbsp;</td><td>Nanosight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software&nbsp;</td><td>Nanosight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mirVANA</td><td>Life Technologies</td><td>AM1560</td><td></td></tr><tr><td>Complete Protease Inhibitor</td><td>Roche verdeeld door Sigma-Aldrich</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon PSQ</td><td>Millipore, Bedford MA</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD63 antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab59479</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tsg101</td><td>Abcam</td><td>ab30871</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie en profilering van microrna-bevattende exosomes van human bile

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome onderzoek in de afgelopen drie jaar sterk uitgebreid de omvang in de richting van identificatie en karakterisering van biomarkers en hun therapeutische toepassingen. Exosomes onlangs aangetoond microRNA (miRs) bevatten. Mirs zich hebben voorgedaan als waardevolle biomarkers voor diagnostische doeleinden. Zoals specimen collectie in klinieken en ziekenhuizen is erg variabel, miRNA isolatie van hele gal varieert aanzienlijk. Robuuste, nauwkeurige en reproduceerbare miRNA profielen van verzamelde monsters gal te bereiken op een eenvoudige wijze vereist de ontwikkeling van een kwalitatief hoogwaardige protocol te isoleren en te karakteriseren exosomes van gal. De werkwijze vereist verscheidene centrifugeren en een filtratiestap met een laatste stap van ultracentrifugatie om de geïsoleerde exosomes pelleteren. Elektronenmicroscopie, Western blots, stroomcytometrie en multiparameter nanodeeltjes optische analyse, indien beschikbaar, zijn cruciaal karakterisering maatregelen om de kwaliteit van de e validerenxosomes. Voor de isolatie van miRNA uit deze exosomes, spiking het lysaat met een aspecifiek synthetische miRNA van een soort zoals Caenorhabditis elegans, dwz Cel-miR-39, is belangrijk voor normalisatie van RNA extractie-efficiëntie. De isolatie van exosome van galvloeistof volgens deze werkwijze kan de succesvolle miRNA profilering van galmonsters bewaard jarenlang bij -80 ° C.

Aangezien exosomes zijn te klein om gedetecteerd door regelmatige microscopie of flowcytometrie, elektronenmicroscopie of nanodeeltje optische analyse worden uitgevoerd. Het nanodeeltje optische analyse heeft het voordeel boven elektronenmicroscopie dat het ook kwantitatief en geeft grootteverdeling en concentratie. Het instrument voert een fijn gefocusseerde laserbundel door een glazen prisma in het monster. De Brownse beweging van de geïsoleerde blaasjes wordt opgevangen via een EMCCD ...

Galvocht is een waardevolle bron van extracellulaire vesiclen/exosomen die potentieel belangrijke biomarkers bevatten. Dit protocol vertegenwoordigt een robuuste methode om exosomen uit menselijk gal te isoleren voor verdere analyses, inclusief miRNA-profilering.

Isolatie en profilering van MicroRNA-bevattende exosomes van Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Het algemene doel van deze methode is om exosomen te isoleren uit menselijk gal voor verdere analyses, waaronder microRNA-profilering. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van leverziekten, zoals de detectie van een specifieke galmarker voor cholangiocarcinomen of andere galwegziekten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze robuust en reproduceerbaar is.Om een endoscopische retrograde cholangiopancreatografie, of ERCP, uit te voeren, begint u door de patiënt in rugligging te plaatsen. Nadat u de patiënt heeft geïntubeerd en een duodenoscoop via de mond van de patiënt heeft ingebracht, voert u deze door naar het tweede deel van het duodenum en identificeert u de papilla major. Cannuleer selectief de galweg door een triple lumen sfincterotoom in te brengen, vooraf geladen met een 0,35-inch of een 0,9-millimeter hydrofiele geleidingsdraad.Bevorder onder fluoroscopische begeleiding de geleidingsdraad naar de linkerlevertraject en breng vervolgens de sfinctrotome vijf centimeter in de galgang om een stabiele positie te verkrijgen. Verwijder de geleidingsdraad, bevestig een spuit van 10 milliliter aan de poort voor de geleidingsdraad via de onderste vergrendeling en gebruik 10 milliliter negatieve druk om de gal te aspireren. Verwijder de spuit met de gal en injecteer, na het opnieuw inbrengen van de geleidingsdraad, contrastmiddel via de injectiepoort om de galwegen op te weken.Breng vervolgens het verzamelde gal over in een buis van 15 milliliter op ijs en, indien bewaard voor later gebruik, centrifugeer het monster bij 500 ×g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten voordat het wordt ingevroren bij minus 80 graden Celsius. Om direct over te gaan tot exosoomisolatie, breng dan 400 µL gal over in een microcentrifugebuis en centrifugeer bij 300 ×g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten om cellen en celresten te pelletteren. Om het supernatant verder te klaren, breng de oplossing over naar nieuwe microcentrifugebuizen en centrifugeer de monsters bij 16.500 ×g en vier graden Celsius gedurende 20 minuten.Verzamel vervolgens in een veiligheidskast de supernatant in een spuit en filtreer deze door een 0,2-micrometer polyethersulfon-membraanfilter om alle resterende deeltjes groter dan 200 nanometer te verwijderen. Overbreng de gefiltreerde supernatant naar ultracentrifugebuisjes en voeg PBS toe tot de buisjes voor ten minste tweederde vol zijn, om te voorkomen dat de buisjes inklappen tijdens het centrifugeren. Pelleteer de exosomen door middel van ultracentrifugatie bij 120.000 ×g en vier graden Celsius gedurende 70 minuten.Een klein, geel pellet bevat de exosomen. Verwijder het supernatant door voorzichtig af te gieten en desinfecteer het afval door bleekmiddel toe te voegen tot een eindconcentratie van 10% volume per volume. Laat dit vervolgens 20 minuten staan.Voor downstream-experimenten kunnen de pellets worden verwerkt in een klein volume van een geschikte oplossing of opnieuw worden gesuspendeerd in 50 tot 100 µL PBS en bewaard worden bij -80 °C voor toekomstig gebruik. Na het bereiden van grids van contrastgekleurde extracellulaire vesicles, of EV's, volgens het tekstprotocol, worden afbeeldingen vastgelegd met een elektronenmicroscoop bij een versnellingsspanning van 80 kV, beginnend bij vergrotingen van 20.000 X en oplopend tot 100.000 X voor het bepalen van de grootte van de deeltjes. Exosomen zijn te klein om te worden gedetecteerd met reguliere microscopie of flowcytometrie; deze figuur toont echter de resultaten van een typische nanoparticle tracking analysis, of NTA, van exosomen, waarbij de concentratie en de grootteverdeling zijn gemeten, welke in dit geïsoleerde menselijke galmonster gemiddeld 97 nm bedroegen.Elektronenmicroscopie kan ook worden gebruikt om de grootte van de geïsoleerde deeltjes in menselijk gal te bevestigen en deze figuur toont een typisch resultaat van transmissie-EM. Deze western blots werden onderzocht op eiwitten die verrijkt zijn in exosomen, zoals de tetraspanine CD63 en Tsg101. Deze real-time amplificatieplot toont een verscheidenheid aan microRNA-soorten geëxtraheerd uit exosomen van menselijk gal.Omdat exosomen geen betrouwbare standaarden hebben zoals 18S of 28S ribosomaal RNA of housekeeping-genen, is het toevoegen van een synthetisch microRNA belangrijk voor de normalisatie. De isolatietechniek voor exosomen kan in drie uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe gal van patiënten of dieren wordt verkregen en verwerkt om extracellulaire vesicles te isoleren en te analyseren.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het monster op 500 G en vier graden gecentrifugeerd moet worden voordat het bij min 80 wordt ingevroren, indien ultracentrifugatie niet mogelijk is. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals microRNA-studies, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals microRNA-profielen. Vergeet niet dat werken met gal extreem gevaarlijk kan zijn aangezien het hepatitis kan bevatten, en voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van handschoenen en een veiligheidsbril moeten altijd worden getroffen tijdens het uitvoeren van deze procedure.Na de ontwikkeling maakte de techniek de weg vrij voor onderzoek in het veld van cholangiocarcinoomonderzoek om extracellulaire blaasjes te verkennen als potentiële biomarker in gal van patiënten met galwegproblemen, zoals een obstructie van de PSA.

isolation-profiling-microrna-containing-exosomes-from-human

Research

JoVE Journal

Medicine

Deze paper toont voor de isolering, zuivering en detectie van exosomes, evenals technieken voor de analyse van hun moleculaire inhoud. Deze methoden zijn aanpasbaar voor exosome isolatie van zowel de media voor celkweek en biologische vloeistoffen, en kan daarna analyse van moleculaire content ook nuttig zijn in functionele studies.

Isolatie en karakterisatie van RNA-bevattende Exosomes

De aanwezigheid van stabiele microRNA (miRNA) in exosomes heeft immense belangstelling gegenereerd als een nieuwe wijze van intercellulaire communicatie, voor hun potentiële nut als biomarkers en als een route voor therapeutische interventie. Hier laten we zien exosome zuivering van het bloed en de cultuur media, gevolgd door kwantitatieve PCR om miRNA's worden vervoerd identificeren.

Zuivering en microRNA Profilering van Exosomes Afgeleid van Blood en cultuur Media

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het extraheren van kleine RNA uit menselijk serum. We hebben deze methode om microRNA kanker serum te isoleren voor gebruik in DNA arrays en ook singleplex kwantitatieve PCR. Het protocol maakt gebruik van fenol en guanidiniumthiocyanaat reagentia met modificaties van hoge kwaliteit RNA opleveren.

Isolatie van Kleine Noncoding RNA&#39;s uit humaan serum

Technieken die een gradiëntprocedure beschrijven om exosomen te scheiden van humaan immunodeficiëntievirus (HIV) deeltjes worden beschreven. Deze procedure werd gebruikt om exosomen te isoleren van HIV-deeltjes in menselijk plasma van met HIV geïnfecteerde personen. De geïsoleerde exosomen werden geanalyseerd op cytokine/chemokine-gehalte.

Isolatie van exosomen uit het plasma van HIV-1 positieve personen

Dit protocol beschrijft de haalbaarheid om miRNA-profilering uit te voeren in exosomen, vrijgegeven in plasma van NSCLC-patiënten, door middel van een commerciële exosome-isolatiekit met Proteinase K en RNAse-behandelingen, om circulatie van miRNA-besmetting te voorkomen en hun biomerkerfuncties in NSCLC te evalueren.

Exosomaal miRNA analyse in niet-kleincellige longkanker (NSCLC) patiënten Plasma Through qPCR: een haalbare Liquid biopsie Tool

MicroRNAs spelen een belangrijke regulerende rol en zijn in opkomst als nieuwe therapeutische doelen voor verschillende ziekten bij de mens. Het is aangetoond dat miRNAs worden vervoerd in high density lipoproteïnen. Wij hebben een eenvoudige methode om gezuiverd HDL geschikt voor miRNA analyse uit menselijk plasma snel isoleren ontwikkeld.

Snelle en vereenvoudigde methode voor High Through-put Isolatie van miRNA uit Highly Purified high density lipoproteïne

Dit protocol beschrijft de isolatie en kwantificering van kleine RNA's met hoge dichtheidslipoproteïnen.

Isolatie van lipoproteïnen met hoge dichtheid voor niet-coderende RNA kwantificering Klein

Extracellulaire vesicules in bloed zijn voorgesteld als nieuwe biomarkers voor verschillende ziekten. Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van grote plasmamembraan-afgeleide microvesicles uit perifere bloedmonsters en hun daaropvolgende analyse door conventionele flowcytometrie en Western Blotting.

Isolatie en karakterisering van microvesicles uit perifeer bloed

Hier presenteren we een protocol om te zuiveren van exosomes van plasma en serum met verminderde CO zuivering van niet-exosomal bloedeiwitten. Het geoptimaliseerde protocol bevat ultrafiltratie, protease behandeling en grootte uitsluiting chromatografie. Verbeterde zuivering van exosomes voordelen downstream analyses, met inbegrip van nauwkeuriger kwantificering van blaasjes en proteomic karakterisering.

Vertering van eiwitten, ultrafiltratie en Size Exclusion Chromatography voor het optimaliseren van het isolement van Exosomes uit menselijk bloed Plasma en Serum

Dit protocol laat zien hoe om te zuiveren van extracellulaire microRNAs van cel voedingsbodems voor kleine RNA bibliotheek constructie en de volgende generatie sequencing. Verschillende kwaliteitscontrole controlepunten worden beschreven om lezers te begrijpen wat u kunt verwachten wanneer u werkt met lage input monsters als exRNAs.

Isoleren, Sequencing en analyseren van extracellulaire MicroRNAs van menselijke mesenchymale stamcellen

Een exosome is een nieuwe generatie van drug delivery vervoerders. Wij opgericht een protocol exosome isolatie met een hoge opbrengst en zuiverheid voor siRNA levering. Wij ook ingekapseld fluorescently geëtiketteerde aspecifieke siRNA in exosomes en onderzocht de cellulaire opname van siRNA-geladen exosomes in kankercellen.

Voorbereiding van Exosomes van siRNA levering aan kankercellen

Leer een robuuste methode voor exosoomisolatie uit menselijke gal via ERCP voor microRNA-profiling. Deze techniek ondersteunt onderzoek naar biomarkers voor leverziekten en cholangiocarcinomen.

Isolatie en profilering van MicroRNA-bevattende exosomes van Human Bile

Meer video's verkennen