Name: Flowcytometrie gebruiken om veranderde bloedvorming in de zich ontwikkelende zebravis te detecteren en te kwantificeren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Leer flowcytometrie om hematopoëtische cellen te kwantificeren in embryonale zebrafish. Deze methode detecteert bloedafwijkingen na genetische manipulatie en biedt een snel, economisch protocol voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De financiering werd verstrekt door de National Institutes of Health (NIH: R15 DK114732-01 aan D.L.S.), de National Science Foundation (NSF: MRI 1626406 tot D.L.S.), en van het Honor's Program aan california state university Chico (naar K.F.R.). De auteurs bedanken Betsey Tamietti voor laboratoriumbeheer en Kathy Johns voor administratieve hulp.

De Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) adviesraad van de California State University, Chico, keurde alle hieronder beschreven methoden goed.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om embryo's te behandelen met 1-fenyl 2-thiourea (PTU; Tabel 1) na 24 uur postfertilisatie (hpf) om pigmentatie te voorkomen die een negatieve invloed heeft op fluorescentiediscriminatie door flowcytometrie. Alle onderstaande procedures zijn aanvaardbaar voor flowcytometrie en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Als iemands doel echter is om de hematopoëtische cellen na FACS te gekweekt, houd je dan aan steriele praktijken bij het verwerken van monsters. Het protocol voor het steriel bleken en bereiden van embryomonsters is eerder beschreven12.
1. Dechorionatie van 48 hpf zebravisembryo's
<ol><li>Met embryo's (minstens 5, maar niet meer dan 200 embryo's) in een plastic petrischaal van 10 cm, kantel de schaal zodat de embryo's naar de onderrand zinken. OPMERKING: Het is gemakkelijk om de schaal te kantelen door het deksel te verwijderen en het deksel onder één rand van de Petrischaal te plaatsen.</li>
	<li>Verwijder en gooi zoveel mogelijk E3 medium (tabel 1) weg en voeg 500 μL dechorionatie protease (10 mg/ml) toe. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Pak na 5 minuten de Petrischaal op (houd alle embryo's aan de onderkant van de plaat) en tik voorzichtig op de zijkant van de Petrischaal, zodat embryo's zachtjes tegen de bodem van de plaat kunnen wrijven om koraal volledig te verwijderen.</li>
	<li>Voeg met een knijpfles ~ 20 ml E3-medium toe om protease te verdunnen. Laat embryo's bezinken en verwijder het E3-medium door te decanteren.</li>
	<li>Herhaal stap 1.4 3x om alle sporen van het dechorionatie protease te verwijderen. OPMERKING: Voor elk afzonderlijk monster dat moet worden geanalyseerd, zijn ten minste 5 embryo's vereist. Deze dechorionatieprocedure biedt plaats aan maximaal 200 embryo's per petrischaal. Monsters kunnen in dit stadium worden gegroepeerd en indien gewenst later worden gescheiden. Als alternatief kan handmatige dechorionatie worden uitgevoerd door de koraallen voorzichtig te scheuren met de tang van de horlogemaker. Dit is voordelig wanneer er kleine aantallen embryo's zijn. Meestal komen zebravissen uit hun koraal met 72 pkf. Ernstig misvormde embryo's kunnen echter niet en vereisen na die tijd dechorionatie (handmatig of chemisch).</li>
</ol>2. Bereiding van embryomonsters voor dissociatie
<ol><li>Plaats met behulp van een P1000 pipet 5−10 embryo's in een enkele microcentrifugebuis van 1,5 ml.</li>
	<li>Verwijder het E3-medium met een pipet en gooi het weg. LET OP: Pipet met zorg omdat embryo's gemakkelijk kunnen worden weggegooid tijdens de volgende stappen.</li>
	<li>Voeg 1 ml 10 mM dithiothreitol (DTT) toe in E3-medium om de slijmlaag rond de embryonale zebravis11,12,13,14te verwijderen . Leg de microcentrifugebuis horizontaal en incubeer gedurende 30 minuten op kamertemperatuur.</li>
</ol>3. Embryodissociatie
<ol><li>Was de embryo's 3x met 1 ml dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) met Ca2+ en Mg2+ om sporen van DTT te verwijderen. Voeg na de laatste wasbeurt 500 μL DPBS toe met Ca2+ en Mg2+ en 5 μL van 5 mg/ml (26 U/ml) dissociatie protease. OPMERKING: Andere isotone gebufferde oplossingen kunnen worden gebruikt, maar ze moeten Ca2+ en Mg2+ bevatten om het dissociatie-enzym goed te laten functioneren.</li>
	<li>Incubeer monsters bij 37 °C op een horizontale orbitale shaker bij 185 tpm gedurende 60 minuten. Trituraatembryo's met een P1000 pipet tot de monsters volledig zijn gedissocieerd. LET OP: Zorg ervoor dat u de embryo's niet overdigest; er moet wat vast weefsel aanwezig zijn en het mag niet volledig homogeen zijn. Het is mogelijk om overdigest, die de doelbloedcellen zal vernietigen die op de stroomcytometer moeten worden waargenomen (Aanvullende figuur 1). OPMERKING: Deze procedure werkt het beste voor 48−72 hpf embryo's. Latere stadia kunnen een langere incubatie met dissociatie protease vereisen. De timing voor verschillende fasen moet empirisch worden bepaald. Er zijn snellere alternatieve methoden om embryonaal weefsel te dissocieren, maar empirisch wordt vastgesteld dat deze methode, hoewel het 60 minuten duurt, zacht en grondig genoeg is om een efficiënte isolatie van levende hematopoëtische cellen mogelijk te maken.</li>
</ol>4. Bereiding van gedissocieerde embryo's voor flowcytometrie
<ol><li>Pipetteer de 5 gedissocieerde embryo's op het bovenste reservoir van een 5 ml polystyreen ronde bodembuis met een 35 μmM celzeefdop.</li>
	<li>Spoel cellen door 4 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zonder Ca2+ of Mg2+ toe te voegen aan de zeefdop van de polystyreenbuis van 5 ml die de gefilterde cellen bevat. OPMERKING: Andere isotone gebufferde oplossingen kunnen ook worden gebruikt, maar ze moeten Ca2+ of Mg2+ missen om het dissociatie-enzym te verdunnen en ineffectief te maken.</li>
	<li>Centrifugeer buizen bij 4 °C en 300 x g gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren. Verwijder en gooi supernatant met een pipet weg. Resuspend de cellen in 500 μL PBS (zonder Ca2+ of Mg2+).</li>
</ol>5. Flow cytometrie
<ol><li>Draai de celsuspensie voorzichtig om en voeg 1:1.000 rode dode celvlek(Tabel met materialen) toe. OPMERKING: De rode dode celvlek is een celdoorlatende kleurstof die het mogelijk maakt dode cellen en vuil uit doelcellen te verwijderen en is een uitstekende keuze van kleurstof voor dode celdiscriminatie, omdat deze wordt opgewekt door de 633 nm-laser, die verschilt van de 488 nm-laser die wordt gebruikt om gemeenschappelijke fluoroforen zoals groen fluorescerend eiwit (GFP) en DsRed op te wekken. Op deze manier is er geen spectrale overlap van dode cellen en transgene bloedcellen. Propidiumjodide (PI) bij 1 mg/ml is een goedkoop alternatief voor de rode dode celvlek, maar zorg ervoor dat u sommige monsters alleen met PI en monsters alleen reserveert met de fluorofoor van belang om de instrumentcompensatie vast te stellen. Anders zullen de signalen van PI en fluoroforen zoals GFP elkaar overlappen, wat resulteert in vals-positieve resultaten. Als de flow cytometer ook een 405 nm laser heeft, zijn ook andere kleurstoffen zoals blue dad cell stain een uitstekende keuze. LET OP: Houd er bij het analyseren van bloedcellen rekening mee dat na 30 minuten bepaalde celtypen de rode dode celvlek beginnen te fagocytose. Houd cellen beschermd tegen licht en op ijs tot analyse en voer flowcytometrie uit binnen 30 minuten na het toevoegen van de kleurstof.</li>
	<li>Flow cytometrie analyse OPMERKING: Elke flowcytometer is een beetje anders, maar de volgende stappen zullen helpen bij het voorbereiden van monsters voor analyse op de meeste machines. Voor gebruikers die nieuw zijn in flowcytometrie, moet u het advies inwinnen van iemand die een expert is op het gebied van het specifieke apparaat. De volgende instructies hebben betrekking op de BD FACSAria Fusion flow cytometer.<ol><li>Zet de cytometer aan en laat lasers 20 minuten opwarmen. Lege afvaltank, vul de manteltank met de juiste oplossing (varieert op basis van flowcytometer) en start het fluidics-systeem. OPMERKING: Er is meestal een bepaalde opstartprocedure voor elk type flowcytometer; volg die opstartprocedure zorgvuldig.</li>
		<li>Teken in de analysesoftware vijf plots (figuur 1A).<ol>
<li>Laat de eerste puntplotmeting voorwaartse spreiding (FSC) op de x-as en zijverstrooiing (SSC) op de y-as. Stel FSC in als lineair en SSC als logboek. OPMERKING: FSC is een meting van de celgrootte en SSC is een meting van granulariteit; dit zal de discriminatie van cellen uit puin mogelijk maken. Embryonale zebravisbloedcelpopulaties scheiden zich niet naar grootte en granulariteit op dezelfde manier als volwassen zebravisbloedcellen die eerder werden beschreven15. In plaats daarvan verschijnen ze in dezelfde populatie met alle andere verteerde embryonale cellen.</li>
			<li>Stel het tweede perceel in om de FSC-hoogte (H) versus de FSC-breedte (W) te onderzoeken. Stel de derde plot in om SSC (H) versus SSC (W) te meten. OPMERKING: Deze stap wordt gebruikt om doubletten uit te sluiten (cellen die aan elkaar vastzitten wanneer ze door de laser gaan).</li>
			<li>Stel de vierde puntplot in om de rode dode celvlek op de x-as te meten (afhankelijk van de cytometer is dit meestal gelijk aan het filter dat wordt gebruikt voor allofycocyanine [APC]) en SSC op de y-as. Hierdoor kunnen levende cellen uit dode cellen worden gediscrimineerd. OPMERKING: Filtersets van elke cytometer kunnen verschillen. Zorg ervoor dat u het juiste detectiefilter gebruikt voor de dode cel discriminatie kleurstof.</li>
			<li>Het vijfde perceel meet de fluorofoor van keuze. Visualiseer dit als een histogram van de fluorofoor (figuur 1) of gebruik een puntplot (Aanvullende figuur 2). OPMERKING: Wanneer u meer dan één fluorofoor bij hetzelfde dier onderzoekt, wordt aanbevolen om een puntplot te gebruiken om beide parameters tegelijkertijd weer te geven. Als er een kans is dat de fluoroforen spectrale overlap met elkaar hebben(aanvullende figuur 2),wordt ook een puntplot aanbevolen. Gebruik de gebiedsinstellingen (A) om het gebied te berekenen onder de curve die wordt gegenereerd door de laserpuls van de cytometer voor alle parameters, omdat ze nauwkeuriger zijn.</li>
		</ol></li>
		<li>Laad het monster en verlaag het debiet zodat het monster niet snel opraakt. Pas de FSC- en SSC-instellingen aan zodat het grootste deel van de celpopulatie duidelijk zichtbaar is (figuur 1A).</li>
		<li>Teken een poort rond de celpopulatie en label deze cellen. Ervoor zorgen dat de tweede puntplot op cellen is gated, doubletten uitsluiten door eerst gating op FSC en vervolgens op SSC singlets.</li>
		<li>Pas op het vierde perceel de instellingen van de rode dode celvlek aan, zodat er duidelijk een negatieve populatie is. Teken een poort rond deze cellen en label ze levende cellen. Op het vijfde perceel, poort op levende cellen en onderzoek fluorofoor negatieve en positieve cellen. Teken een poort rond de positieve cellen. OPMERKING: Deze hiërarchische gatingstrategie onderzoekt enkele fluorofoor+ cellen die zich in de poort van de levende cellen bevinden, die zich ook in de celpoort bevinden. Zorg ervoor dat u de poorten goed instelt. Deze poorten kunnen worden aangepast, afhankelijk van het experiment.</li>
		<li>Voer elk monster uit en verzamel ten minste 25.000 live celgebeurtenissen.</li>
		<li>Volg de uitschakelprocedure om de fluidics uit te schakelen. Vul de hulstank bij en leeg de afvaltank. OPMERKING: Het is vaak moeilijk om fluorofoor+ cellen te visualiseren wanneer de eiwitexpressie laag is of de celpopulatie zeldzaam is. Om ervoor te zorgen dat de parameters correct zijn ingesteld, moeten fluorofoor- embryo's van broers en zussen worden voorbereid om poorten goed te trekken en laserspanningen aan te passen (Aanvullende figuur 2). Als de doelcelpopulatie zeldzaam is, verzamelt u meer dan 25.000 gebeurtenissen. Met 5−10 verteerde dieren moet men miljoenen gebeurtenissen kunnen verzamelen. Het totale aantal fluorofoor+ cellen kan ook worden verkregen met deze gegevens. Tel gewoon het totale aantal cellen in het monster met een hemocytometer en vermenigvuldig het percentage fluorofoor+ cellen om het absolute aantal fluorofoor+ cellen per vis te verkrijgen.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-46 (1996).</li>
<li>Weinstein, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+mutations+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic mutations in the zebrafish.</a> Development. , 303-309 (1996).</li>
<li>Ransom, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+zebrafish+mutants+with+defects+in+embryonic+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis.</a> Development. 123, 311-319 (1996).</li>
<li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+insertional+mutagenesis+screen+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish.</a> Genes & Development. 13, 2713-2724 (1999).</li>
<li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383, 829-832 (1996).</li>
<li>Yeh, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+chemical+modifiers+of+oncogene-regulated+hematopoietic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation.</a> Nature Chemical Biology. 5, 236-243 (2009).</li>
<li>Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+genetic+screen+in+zebrafish+for+pathways+interacting+with+cdx4+in+primitive+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis.</a> Zebrafish. 7, 61-68 (2010).</li>
<li>Ridges, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+screen+identifies+novel+compound+with+selective+toxicity+against+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia.</a> Blood. 119, 5621-5631 (2012).</li>
<li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+regulates+vertebrate+haematopoietic+stem+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.</a> Nature. 447, 1007-1011 (2007).</li>
<li>Astuti, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Functional+Bioluminescent+Zebrafish+Screen+for+Enhancing+Hematopoietic+Cell+Homing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing.</a> Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).</li>
<li>Stachura, D. L., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+dissection+of+zebrafish+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis.</a> Methods in Cell Biology. 133, 11-53 (2016).</li>
<li>Berrun, A. C., Stachura, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+In+Vitro+Assay+to+Quantitate+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+%28HSPCs%29+in+Developing+Zebrafish+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56836(2017).</li>
<li>Westerfield, M., Zon, L. I., Detrich, H. W. III <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22Essential+Zebrafish+Methods%3A+Cell+and+Developmental+Biology%22">Essential Zebrafish Methods: Cell and Developmental Biology</a>. , Academic Press. Cambridge, MA. (2009).</li>
<li>Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish Kidney Development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDrummond%2C+IA+%22The+Zebrafish%3A+Cellular+and+Developmental+Biology%2C+Part+A%22">The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A</a>. Detrich, H. W. III, Westerfield, M., Zon, L. I. 100, Elsevier. Boston, MA. 233-260 (2010).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nature Immunology. 4, 1238-1246 (2003).</li>
<li>Ganis, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+globin+switching+occurs+in+two+developmental+stages+and+is+controlled+by+the+LCR%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR.</a> Developmental Biology. 366, 185-194 (2012).</li>
<li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li>
<li>Lin, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106, 3803-3810 (2005).</li>
<li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122, e1-e11 (2013).</li>
<li>Ding, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+High-Throughput+Flow+Cytometry+in+Early+Drug+Discovery%3A+An+AstraZeneca+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective.</a> SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).</li>
<li>Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+flow+cytometry+for+drug+discovery%3A+principles%2C+applications%2C+and+case+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies.</a> Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).</li>
<li>Joslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fully+Automated+High-Throughput+Flow+Cytometry+Screening+System+Enabling+Phenotypic+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery.</a> SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).</li>
</ol>

D.L.S. is een wetenschappelijk adviseur en heeft compensatie ontvangen van Finless Foods, Inc. en Xytogen Biotech, Inc. K.F.R. verklaart geen concurrerende belangen.

Zebravissen zijn een uitstekend modelsysteem voor het bestuderen van primitieve en definitieve gewervelde hematopoiese. In de afgelopen decennia zijn meerdere tests ontwikkeld en verfijnd, waardoor zebravissen een snel en economisch model kunnen worden voor het testen van medicijnen, het genereren en testen van genetische mutanten, en over het algemeen kunnen onderzoekers moleculaire paden analyseren die essentieel zijn voor hematopoiese. Dit protocol maakt gebruik van embryonale zebravissen die snelle gegevensverzamelin...

Bloedproductie (hematopoiese) is een essentieel ontwikkelingsproces dat voor het eerst begint in het vroege embryo. Dit proces begint met het genereren van primitieve rode bloedcellen en macrofagen rechtstreeks van mesoderm, en verschuift later naar de productie van hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPCs). Deze stamcellen, die multipotent zijn, genereren alle variëteiten van volwassen bloedcellen in het organisme. In staat tot zelfvernieuwing wordt het systeem voortdurend aangevuld via deze HSPCs. Hoewel dit proces vroeg in de ontwikkeling begint, gaat hematopoiese door voor het leven van het dier, waardoor zuurstof naar verre plaatsen van het lichaam kan worden getransporteerd, bloedingen na letsel kunnen worden gestopt en het lichaam tegen infectie kan worden beschermd. De ontwikkeling van dit complexe systeem wordt tijdelijk en ruimtelijk gecontroleerd tijdens de ontwikkeling en eventuele verstoringen in de bloedcelproductie kunnen catastrofaal zijn voor het organisme, wat resulteert in bloedarmoede, trombocytopenie, leukopenie en leukemie.
Een populair diermodel dat wordt gebruikt voor hematopoëtisch onderzoek is de zebravis (Danio rerio) omdat ze een vergelijkbare bloedontwikkeling hebben in vergelijking met mensen. In feite worden veel van de genen en moleculaire paden die tijdens hematopoiese worden gebruikt, bewaard tijdens de evolutie van gewervelde dieren, waardoor we meer te weten kunnen komen over menselijke genen door zebravissen te bestuderen. Belangrijk is dat zebravisembryo's zich buiten het lichaam ontwikkelen en binnen 7 dagen de meeste volwassen bloedceltypen hebben gegenereerd, waardoor het hematopoëtische systeem in korte tijd direct kan worden gevist. Zebravissen zijn ook extreem vruchtbaar, waardoor onderzoekers in korte tijd een groter aantal monsters kunnen observeren, wat ook belangrijk is voor het genereren van reproduceerbare gegevens. De korte generatietijd en externe ontwikkeling van de zebravis zorgt voor eenvoudigere manipulatie en observatie tijdens mutagenesestudies1,2,3,4,5 en drugsscreening6,7,8,9,10. Hierdoor kan een panel van veelbelovende therapeutische verbindingen voor menselijke bloedaandoeningen snel en efficiënt worden getest.
Belangrijk is dat zebravissen ook genetisch vatbaar zijn en dat het genoom wordt gesequenced en geannoteerd. Deze tractabiliteit maakt het mogelijk om omgekeerde genetische technieken zoals morfolino- (MO-) gemedieerde knockdown en CRISPR-gemedieerde genetische ablatie uit te voeren. Zebravissen hebben ook hun nut bewezen als model om voorwaartse genetische schermen uit te voeren; veel essentiële genen en paden die betrokken zijn bij gewervelde bloedvorming zijn op deze manier ontdekt. Talrijke methoden voor het observeren van bloedcellen zijn ook ontwikkeld bij zebravissen. Hoewel er traditionele histologische kleuringstechnieken bestaan, is het ook mogelijk om in situ hybridisatie uit te voeren voor bloedspecifieke transcripties. Belangrijk is dat er ook tal van transgene vislijnen bestaan waarbij fluorescerende eiwitten worden uitgedrukt door afstammingsspecifieke promotors, waardoor de etikettering van specifieke bloedcellen met fluorescerende eiwitten11mogelijk is. Dit stelt onderzoekers in staat om up-to-the-minute observatie van het ontstaan, de expansie en de regulatie van bloedcellen in een levend organisme in de loop van de tijd uit te voeren.
Over het algemeen heeft het behoud van het hematopoëtische systeem, de aanwezigheid en gemakkelijke ontwikkeling van transgene lijnen, eenvoudige visualisatie en korte generatietijd de zebravis een economisch, snel en aanpasbaar model van hematopoiese gemaakt. Om de toolbox met technieken voor zebravisonderzoekers te verbeteren, ontwikkelden we deze test om het aantal bloedcellen in embryo's robuust te kwantificeren. De methode omvat het verteren van transgene dieren en het uitvoeren van flowcytometrie voor fluorescerende bloedcellen. Op deze manier kunnen bloedcellen van gemuteerde dieren, het effect van MO- en CRISPR-modificatie en het effect van kleine moleculen op een snelle en reproduceerbare manier kwantitatief worden geanalyseerd. Deze onderzoeken zijn gebruiksvriendelijke en economische manieren om bloedcellen op te sommen, waardoor onderzoek van hun generatie, proliferatie en onderhoud in de loop van de tijd mogelijk is.

<table><tbody><tr><td>1.5 ml MCF tube</td><td>FisherBrand</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>10 mm Polystyrene easygrip Petri dish</td><td>Corning Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap</td><td>Corning Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria Fusion flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dithiolthreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+</td><td>Life Technologies</td><td>14080-055</td><td></td></tr><tr><td>FBS 500 mL</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-108</td><td></td></tr><tr><td>HyClone PBS (1x)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>sh30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Librease</td><td>Roche Sigma-Aldrich</td><td>5401119001</td><td>dissociation protease</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche Sigma-Aldrich</td><td>11459643001</td><td>dechorionation protease</td></tr><tr><td>SYTOX Red Dead Cell Stain</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>S34859</td><td></td></tr></tbody></table>

flowcytometrie gebruiken om veranderde bloedvorming in de zich ontwikkelende zebravis te detecteren en te kwantificeren

Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

De diversiteit van cellijnen die volwassen bloed in gewervelde dieren omvatten, komt voort uit de differentiatie van hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPCs). Dit is een kritisch proces dat optreedt gedurende de hele levensduur van organismen, en verstoring van de moleculaire paden die betrokken zijn bij embryogenese kan catastrofale gevolgen op lange termijn hebben. Om een veelheid van redenen is zebravis (Danio rerio) een modelorganisme geworden om hematopoiese te bestuderen. Zebravisembryo's ontwikkelen zich extern en hebben na 7 dagen postfertilisatie (dpf) de meeste subtypes van definitieve bloedcellen geproduceerd die hun leven lang zullen aanhouden. Er zijn testen ontwikkeld om het aantal hematopoëtische cellen te beoordelen, voornamelijk met behulp van specifieke histologische vlekken, in situ hybridisatietechnieken en microscopie van transgene dieren die bloedcelspecifieke promotors gebruiken die de expressie van fluorescerende eiwitten stimuleren. De meeste kleuringstesten en in situ hybridisatietechnieken kwantificeren echter niet nauwkeurig het aantal aanwezige bloedcellen; alleen grote verschillen in celnummers zijn gemakkelijk te visualiseren. Het gebruik van transgene dieren en het analyseren van individuen met fluorescerende of confocale microscopie kan worden uitgevoerd, maar de kwantificering van deze testen is afhankelijk van handmatig tellen of het gebruik van dure beeldvormingssoftware, die beide fouten kunnen maken. De ontwikkeling van aanvullende methoden om het aantal bloedcellen te beoordelen zou economisch, sneller en zelfs geautomatiseerd zijn om snel het effect van CRISPR-gemedieerde genetische modificatie, morfolino-gemedieerde transcriptiereductie en het effect van medicijnverbindingen die hematopoiese op grote schaal beïnvloeden, snel te beoordelen. Deze nieuwe test om bloedcellen te kwantificeren wordt uitgevoerd door hele zebravisembryo's te dissocieren en de hoeveelheid fluorescerend gelabelde bloedcellen te analyseren. Deze assays moeten het mogelijk maken om moleculaire routes op te helderen die verantwoordelijk zijn voor de vorming, uitbreiding en regulatie van bloedcellen tijdens embryogenese, waardoor onderzoekers nieuwe factoren kunnen ontdekken die zijn veranderd tijdens bloedziekten, evenals paden die essentieel zijn tijdens de evolutie van gewervelde hematopoiese.

Om rode bloedcellen in embryonale zebravissen op te sommen, werden lcr:GFP16 embryo's geïnjecteerd in het eencellige stadium met PBS, 7,0 ng/nL ism1 MO, of 7,0 ng/nL ism1 MO met 7,0 ng ism1 mRNA12. Bij 48 hpf werden ze verteerd en onderworpen aan flow cytometrie analyse. Na analyse van het percentage GFP+ rode bloedcellen uit elk monster (elk monster bestaat uit 5 willekeurig geselecteerde embry...

Deze test is een eenvoudige methode om hematopoëtische cellen te kwantificeren bij de ontwikkeling van embryonale zebravissen. Bloedcellen van gedissocieerde zebravissen worden onderworpen aan flow cytometrie analyse. Dit maakt het mogelijk om bloeddefecten bij gemuteerde dieren en na genetische modificatie te detecteren.

Flowcytometrie gebruiken om veranderde bloedvorming in de zich ontwikkelende zebravis te detecteren en te kwantificeren

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...

Dit protocol is belangrijk omdat het de knockdown en overexpressie van genen in een zich ontwikkelende vis mogelijk maakt, en de kwantificering van die downstream-effecten op bloedcellen. Dit protocol is snel, eenvoudig uit te voeren, economisch en eenvoudig te automatiseren met toegang tot de juiste instrumentatie. Kristen Rueb, een niet-gegradueerde onderzoeker in het laboratorium, demonstreert deze procedure.Begin met het overbrengen van tussen de vijf en 200, 48 uur na de bevruchting embryo's in een plastic petrischaal van 10 centimeter. Kantel de schaal zodat het embryo naar de onderrand zakt en verwijder zoveel mogelijk E3-medium uit de schaal. Voeg vervolgens 500 microliter dechorionatie protease toe aan de embryo's.Na vijf minuten bij kamertemperatuur, kantel alle embryo's opnieuw naar de onderkant van de plaat en tik voorzichtig op de zijkant van de schaal, zodat de embryo's zachtjes tegen de bodem van de plaat kunnen wrijven om hun koraal volledig te verwijderen. Voeg met behulp van een knijpfles ongeveer 20 milliliter E3-medium toe om het protease te verdunnen en de embryo's te laten bezinken. Decanteer vervolgens het medium en spoel de embryo's nog drie keer met vers medium, zoals zojuist is aangetoond om alle sporen van het protease te verwijderen.Om de embryo's voor te bereiden op dissociatie, gebruikt u een P1000 pipet om vijf tot tien embryo's over te brengen in één microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en het overgedragen E3-medium te aspireren. Voeg vervolgens een milliliter van 10 millimolar DTT in E3 medium toe aan de embryonale zebravis en plaats de microcentrifugebuis gedurende 30 minuten horizontaal bij kamertemperatuur om de slijmlaag te verwijderen. Was voor embryodissociatie de met DTT behandelde embryo's driemaal met één milliliter DPBS aangevuld met calcium en magnesium per wasbeurt.Alvorens 500 microliter DPBS aangevuld met calcium en magnesium toe te voegen, en vijf microliter van vijf milligram per milliliter, dissociatie protease. Incubeer vervolgens de monsters bij 37 graden Celsius op een horizontale orbitale shaker met 185 omwentelingen per minuut gedurende 60 minuten. Zorg ervoor dat u de embryo's regelmatig controleert, zodat u ze niet te veel verteert.Wanneer een niet volledig homogeen monster met wat vast weefsel aanwezig kan worden waargenomen, tritureer de embryo's met een P1000 pipet totdat het monster volledig is gedissocieerd. Om de gedissocieerde zebravis embryonale cellen voor te bereiden op flowcytometrie, brengt u het hele celmonster over op het bovenste reservoir van een vijf milliliter polystyreen ronde bodembuis, met een 35 micrometer celzeefdop. Spoel de dop af met vier milliliter PBS zonder calcium of magnesium en pellet de cellen door centrifugeren.Resuspend de cellen vervolgens in 500 microliters PBS zonder calcium en magnesium per tube. Voor flow cytometrische analyse van de zebravis embryonale cellen, draai voorzichtig de cel suspensussingen voordat een een-op-een duizend verdunning van rode dode cel vlek toe te voegen aan elke buis. Binnen 30 minuten na het aanbrengen van de dode celvlek, leeg de afvaltank, vul de manteltank met de juiste oplossing en start het vloeistofsysteem van de flowcytometer.Teken in de analysesoftware vijf plots en stel de eerste plot in om voorwaarts versus zijverstrooiing te meten. Stel de voorwaartse spreiding in op lineair en de zijstrooiing op logaritmisch. Stel de tweede plot in om de voorwaartse spreidingshoogte versus de breedte van de voorwaartse spreiding te meten en de derde plot om de spreidingshoogte versus de breedte van de zijstrooiing te meten.Stel de vierde plot in om de rode dode celvlek op de x-as te meten en zijverstrooiing op de y-as om de discriminatie van leven uit dode cellen mogelijk te maken. Het vijfde perceel moet worden ingesteld om de fluorofoor van keuze te meten. Wanneer alle plots zijn ingesteld, laadt u het monster op de cytometer en vermindert u het debiet, zodat de cellen niet snel opraken.Pas de instellingen voor voor- en zijstrooiing aan, zodat het grootste deel van de celpopulatie duidelijk kan worden waargenomen en teken een poort rond de celpopulatie. Label deze poortcellen. Met de tweede punt plot gated op de cellen, gate op voorwaartse scatter en de side scatter singlets om doubletten uit te sluiten.Pas in het vierde plot de instellingen voor rode dode celvlekken aan zodat er een duidelijk negatieve populatie is. Teken een poort rond deze cellen en label deze poort levende cellen. In het vijfde perceel, poort op de levende cellen en teken een poort rond de positieve cellen, voer dan elk monster uit dat ten minste 25.000 live celgebeurtenissen verzamelt.Wanneer alle monsters zijn geanalyseerd, volgt u de uitschakelingsprocedure om de fluidics uit te schakelen, de manteltank bij te vullen en de afvaltank te legen. Na analyse van het percentage GFP-positieve rode bloedcellen van elk embryonaal zebravismonster, kan het gemiddelde van alle controlegroep worden berekend. Meestal wordt het gemiddelde ingesteld als één en worden alle percentages berekend op basis van dit referentiepunt.In deze representatieve analyse werd vastgesteld dat het verminderen van het ISM1-transcript met een specifiek morfolino het aantal GFP-positieve rode bloedcellen binnen 48 uur na de bevruchting van embryo's vermindert. Door deze verlaging van de ISM1-morfolinospiegels met exogene mRNA te redden, wordt het aantal rode bloedcellen weer normaal. Een goede spijsvertering van de monsters is van cruciaal belang.Als u over- of onderverteerd wordt, krijgt u niet de juiste resultaten. Als er een faxapparaat beschikbaar is, kunnen onderzoekers de bloedcellen verzamelen door te sorteren op in vitro kweek, RNA-sequencing en kwantitatieve RT-PCR.

using-flow-cytometry-to-detect-quantitate-altered-blood-formation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Een methode wordt beschreven om enkele cellen met een gekooide fluorescerend eiwit met behulp van twee-foton absorptie van een Ti photoactivate: Sapphire femtoseconde laser oscillator. Het lot kaart brengen van de gefotoactiveerd cel, wordt immunohistochemie gebruikt. Deze techniek kan worden toegepast op elk celtype.

Single Cell Fate Mapping in de zebravis

Een snelle manier om immunokleuring van zebravis embryonale hart gedrag wordt beschreven. In vergelijking met de ganse berg immunokleuring aanpak, deze methode verhoogt dramatisch de penetratie van de antilichamen, die het mogelijk maakt het verkrijgen van een hoge resolutie beelden, die cellulaire / subcellulaire structuren openbaren in het hart in een veel lagere verwerkingstijd.

Immunokleuring van ontleed zebravis embryonale hart

Dit artikel presenteert een techniek voor de inzameling van bloed uit de dorsale aorta van de zebravis. Het geeft ook instructies voor het verkrijgen van serum voor gebruik in biochemische analyses, zoals tests voor het bepalen van cholesterol en triglyceriden.

Bloedafname voor biochemische analyse bij volwassen zebravis

Beeldvorming van cerebrovasculaire ontwikkeling in larvale zebravis wordt beschreven. Technieken om 3D-beeldvorming te vergemakkelijken en het gebruik van chemische behandelingen cerebrovasculaire ontwikkeling passen zijn ook aanwezig.

Imaging en 3D Reconstructie van cerebrovasculair Structuren in embryonale zebravis

Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren van enkele cellen uit zebravis-embryo's, het verrijken van cellen van belang, het vastleggen van zebraviscellen in microfluïdische gebaseerde enkelcellige multiplexsystemen en het beoordelen van genexpressie uit enkele cellen.

Isolatie en karakterisering van enkele cellen van zebravis embryo&#39;s

Hier presenteren we een eenvoudige methode om te kwantificeren van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen cellen (HSPCs) in embryonale zebrafish. HSPCs van gedissocieerde zebrafish zijn verguld in methylcellulose met ondersteunende factoren, differentiëren in volwassen bloed. Hierdoor kan de detectie van bloed gebreken en kunt drug screening om te gemakkelijk worden uitgevoerd.

Ontwikkeling van een In Vitro Assay voor het kwantificeren van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen cellen (HSPCs) bij de ontwikkeling van de zebravis embryo 's

In vivo imaging is een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om de cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van het zenuwstelsel te onderzoeken. Hier beschrijven we een techniek voor het gebruik van time-lapse confocale microscopie om grote aantallen multicolor Brainbow-gelabelde cellen in real time te visualiseren binnen het zich ontwikkelende zebraviszenuwstelsel.

Visualiseren van de zich ontwikkelende hersenen in levende zebravissen met behulp van Brainbow en Time-lapse Confocalimaging

We beschrijven een protocol voor xenotransplantatie in de dooier van transparante zebravisembryo's dat wordt geoptimaliseerd door een eenvoudige, snelle stadiëringsmethode. Analyses na injectie omvatten overleving en het beoordelen van de ziektelast van xenogetransplanteerde cellen door middel van flowcytometrie.

Een eenvoudige, snelle en effectieve methode voor tumor xenotransplantatie analyse in transparante zebravis embryo's

Dit protocol beschrijft een goedkope lichtmicroscopiemethode om de cardiale morfologie en functie in zebravisembryo's te beoordelen, waardoor een reproduceerbare evaluatie van ontwikkelingscardiotoxiciteit mogelijk is zonder dat er geavanceerde beeldvormingssystemen nodig zijn.

Functionele cardiale beeldvorming in zebravisembryo's met behulp van standaardmicroscopie en videoanalyse: toepassingen in milieu- en biomedisch onderzoek

In deze studie beschrijven we een eenvoudige methode om Evans Blue Dye (EBD) analyse uit te voeren op zebravislarven. Deze techniek is een krachtig hulpmiddel voor de karakterisering van de integriteit van skeletspieren en de afbakening van zebravismodellen van spierdystrofie, en is een waardevolle methode voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische behandelingen.

Analyse van de zebravis Larven skeletspieren Integriteit met Evans Blue Dye

Leer flowcytometrie om hematopoëtische cellen te kwantificeren in embryonale zebrafish. Deze methode detecteert bloedafwijkingen na genetische manipulatie en biedt een snel, economisch protocol voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

Flowcytometrie gebruiken om veranderde bloedvorming in de zich ontwikkelende zebravis te detecteren en te kwantificeren

Meer video's verkennen