Name: Twee flow cytometrische benaderingen van NKG2D Ligand-oppervlaktedetectie om stamcellen te onderscheiden van bulksubpopulaties bij acute myeloïde leukemie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 24 s
Description: Leer twee flow cytometrische methoden om NKG2D liganden te detecteren op acute myeloïde leukemiecellen. Deze technieken scheiden leukemische stamcellen van bulkpopulaties voor verdere karakterisering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Swiss National Science Foundation (179239), de Foundation for Fight Against Cancer (Zuerich), de Wilhelm Sander Foundation aan CL (2019.042.1) en de Novartis Foundation for medical-biological research aan C.L. Bovendien heeft dit project financiering ontvangen van het horizon 2020-onderzoek- en innovatieprogramma van de Europese Unie in het kader van de Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst nr. 765104. We danken de Flow Cytometry Facility in Basel voor de steun.

Patiëntenmonsters werden verzameld na goedkeuring door de Ethics Review Board van de universitaire ziekenhuizen van Basel en Tuebingen.
1. Biotinylering van het NKG2D fusie-eiwit
OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd met een biotinyleringskit (zie materiaaltabel)volgens de instructies van de fabrikant. Deze stap van het protocol moet ten minste 24 uur vóór de kleuring worden uitgevoerd. Het biotinylated NKG2D fusie-eiwit moet worden opgeslagen bij -20 °C.
<ol><li>Ontdooi zowel het biotine als de NKG2D fusie-eiwitbuizen bij kamertemperatuur (RT). OPMERKING: Als de cellen steriel moeten zijn voor verder experimenteel gebruik (injectie bij muizen, kolonievormende eenheidstesten, enz.), reconstitueer dan het fusie-eiwit onder een laminaire stroomkap om besmetting te voorkomen. Anders kan elke stap op een bank worden uitgevoerd.</li>
	<li>Draai snel de 50μg gevlyfiliseerd NKG2D-fusie-eiwit om. Voeg 500 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe om het poeder te reconstrueren en meng grondig met een P1000 micropipet.</li>
	<li>Voeg 100 μL van het NKG2DL-fusie-eiwit toe aan een biotinebuis om een uiteindelijke voorraadconcentratie van 100 μg/ml te verkrijgen.</li>
	<li>Meng de oplossing grondig door continu te resuspenderen met een P100 micropipet.</li>
	<li>Incubeer de fusie-eiwit/biotineoplossing gedurende 24 uur bij een gecontroleerde RT. Het fusie-eiwit is nu klaar voor gebruik.</li>
</ol>2. Ontdooien van primaire AML-cellen
OPMERKING: Ongeveer 5.000.000 bevroren leukemische cellen per patiënt opgeslagen in vloeibare stikstof werden ontdooid en vervolgens meteen gebruikt voor de test. Leukemische cellen werden verkregen en ingevroren zoals eerder beschreven15. Kortom, perifere bloedmonsters verzameld van patiënten met AML en hoge blast cell percentages (>90% van de blasten onder mononucleaire cellen) werden verwerkt met een dichtheidsgradiëntscheiding om mononucleaire cellen te verkrijgen en vervolgens ingevroren in foetale kalfsserum (FCS) met 10% dimethylsulfoxideoplossing (DMSO). Celaantallen zeer gevarieerd tussen patiënten in afhankelijkheid van de leukocytenconcentratie bij de patiënt (bereik: 1.000.000 tot 30.000.000 leukemische cellen per ml bloed).
<ol><li>Pre-warm RPMI-medium met 10% FCS bij 37 °C met behulp van een waterbad. Voeg voor elke flacon AML-cellen (tot 30.000.000 cellen in 1 ml FCS + 10% DMSO) 10 ml voorverwarmd medium toe aan een reactiebuis van 15 ml.</li>
	<li>Verwijder het cryoviale met primaire AML uit de opslag van vloeibare stikstof en ontdooi de cellen onmiddellijk met een waterbad van 37 °C. Beweeg de buis voorzichtig heen en weer in het water, zodat de inhoud van de flacon kan ontdooien totdat er nog maar een klein ijskristal over is.</li>
	<li>Breng de ontdooide cellen onmiddellijk over in de medium-bevattende buis en spoel de flacon af met 1 ml medium.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten op 300 x g en gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren.</li>
	<li>Was de cellen met 5 ml RPMI-medium met 10% FCS en centrifugeer gedurende 10 minuten op 300 x g.</li>
</ol>3. Celtelling
<ol><li>Resuspendeer de celkorrel in een bekend volume RPMI-medium dat 10% FCS bevat.</li>
	<li>Breng een klein volume van de celsuspensie over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml en verdun in een bekende verhouding met trypanblauw of een andere alternatieve kleurstof die live cel/dode celdiscriminatie mogelijk maakt.</li>
	<li>Gebruik elk apparaat om de cellen te tellen.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten op 300 x g en gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren.</li>
</ol>4. Kleuring van primaire AML-cellen met behulp van het biotinylated NKG2D-fusie-eiwit
<ol><li>Bereid de kleuringsbuffer voor door 500 ml PBS aan te vullen met runderserumalbumine (BSA) en ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) tot een eindconcentratie van respectievelijk 0,07 mM en 2 mM. Stel indien nodig de pH (7,2–7,4) in.</li>
	<li>Resuspendeer de celkorrel met kleuringsbuffer tot een eindconcentratie van 0,5 x 107 cellen/ml. OPMERKING: Optioneel kunnen de cellen vóór de kleuring worden geïncubeerd met een blokkeermiddel (bijv. hIgG (1μg/ml) gedurende 30 minuten bij RT of FcR-blocking agent)..</li>
	<li>Breng 100 μL van de celsuspensie over naar een celkweek 96-put U-bodemplaat en centrifugeer de plaat gedurende 10 minuten op 300 x g. Gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren.</li>
	<li>Bereid een mastermix van biotinylated NKG2D fusion protein voor, zodat cellen worden geresuspendeerd in een eindvolume van 50 μL per put met een eindconcentratie van 10 μg/ml per put.</li>
	<li>Voeg de mastermix, bereid in stap 4.4, toe met behulp van een pipet van 100 μL en resuspend de celkorrels met een meerkanaalspipet van 300 μL. OPMERKING: Verklein het uiteindelijke volume op basis van het aantal cellen om de hoeveelheid fusie-eiwit te verminderen die nodig is voor de kleuring.</li>
	<li>Incubeer de celsuspensie gedurende 25 minuten bij RT of 50 min bij 4 °C.</li>
	<li>Was de cellen door 200 μL kleurbuffer per put toe te voegen met een 300 μL meerkanaals pipet.</li>
	<li>Centrifugeer de plaat gedurende 10 minuten op 300 x g en gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren.</li>
	<li>Herhaal stap 4.7 en 4.8. OPMERKING: De hier beschreven kleuring wordt uitgevoerd in een celkweek 96-put U-bodemplaat. Daarom worden wasstappen twee keer uitgevoerd vanwege de kleine volumecapaciteit van dergelijke platen. De kleuring kan ook in andere buizen worden uitgevoerd en wasstappen kunnen dan slechts één keer worden uitgevoerd met een groter volume.</li>
	<li>Bereid een mastermix met Streptavidin-PE (zie tabel 1 voor verdunningen) zodat cellen worden geresuspendeerd in een eindvolume van 50 μL. OPMERKING: Voeg selectieantistoffen toe voor uw celtype als bijv. CD33, CD34.... voor AML.</li>
	<li>Voeg de mastermix, bereid in stap 4.10, toe met een pipet van 100 μL en resuspend de celkorrels met een meerkanaalspipet van 300 μL.</li>
	<li>Incubeer de celsuspensingen gedurende 15 minuten bij RT of 30 minuten bij 4 °C in het donker.</li>
	<li>Was de cellen door 200 μL kleurbuffer per put toe te voegen met een 300 μL meerkanaals pipet.</li>
	<li>Centrifugeer de plaat gedurende 10 minuten op 300 x g en gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren.</li>
	<li>Herhaal stap 4.13 en 4.14.</li>
	<li>Bereid een oplossing van kleuringsbuffer met inbegrip van 7-AAD (7-Aminoactinomycine D, 1:1000) of een reagens om onderscheid te maken tussen levende en dode cellen.</li>
	<li>Resuspend celkorrels in 200 μL kleurbuffer + 7-AAD bereid in stap 4.16 bij het gebruik van een 300 μL meerkanaals micropipet.</li>
	<li>Analyseer de cellen met behulp van een flow cytometrie apparaat.</li>
</ol>5. Kleuring van enkelvoudige of gepoolde enkelvoudige anti-NKG2DL antilichamen
<ol><li>Gebruik dezelfde celsuspensie als in stap 4.2.</li>
	<li>Breng 100 μL van de celsuspensie over naar een celkweekplaat met een 96-put U-bodemplaat met behulp van een meerkanaalspipet van 300 μL en centrifugeer de plaat gedurende 10 minuten op 300 x g. Gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren.</li>
	<li>Bereid voor elk primair antilichaam of gepoolde antilichamen een antilichaamstammix voor (zie tabel 2 voor verdunningen) zodat de cellen in een eindvolume van 50 μL worden geresuspendeerd.</li>
	<li>Voeg de mastermix, bereid in stap 5.3, toe met behulp van een pipet van 100 μL en resuspend de celkorrels met een meerkanaalspipet van 300 μL.</li>
	<li>Incubeer de cellen gedurende 25 minuten bij RT.</li>
	<li>Was de cellen door 200 μL kleurbuffer per put toe te voegen met behulp van een 300 μL meerkanaals pipet.</li>
	<li>Centrifugeer de celkweek 96-well U-bottom plaat op 300 x g gedurende 10 min en gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren.</li>
	<li>Herhaal stap 5.6 en 5.7.</li>
	<li>Bereid een antilichaam master mix voor door het secundaire antilichaam toe te voegen (zie tabel 2 voor verdunningen) zodat de cellen worden geresuspendeerd in een eindvolume van 50 μL per put.</li>
	<li>Voeg de mastermix, bereid in stap 5.9, toe met behulp van een pipet van 100 μL en resuspend de celkorrels met een meerkanaalspipet van 300 μL.</li>
	<li>Incubeer gedurende 15 minuten bij RT of 30 minuten bij 4 °C in het donker.</li>
	<li>Was door 200 μL kleurbuffer per put toe te voegen met behulp van een meerkanaalspipet van 300 μL.</li>
	<li>Centrifugeer de celsuspensie gedurende 10 minuten op 300 x g en gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren.</li>
	<li>Herhaal stap 5.12 en 5.13.</li>
	<li>Resuspend celkorrels in 200 μL kleurbuffer met 7-AAD bereid in stap 4.16.</li>
	<li>Analyseer de cellen met behulp van een flowcytometrieapparaat zoals beschreven in stap 6.</li>
</ol>6. Gegevensverwerving
OPMERKING: Zorg ervoor dat de wekelijkse kwaliteitscontroles van de flowcytometer worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de lasers goed functioneren. Voor het hier gepresenteerde protocol wordt een wekelijks Cytometer en Tracking (CTS) proces uitgevoerd met relatieve kralen om laserprestaties op alle kanalen te controleren. Na het CTS worden 10.000 gebeurtenissen geregistreerd met behulp van de 8-piek kralen als interne controle. Alle pieken moeten zich in dezelfde positie binnen hun poorten bevinden en goed van elkaar gescheiden zijn.
<ol><li>Maak de matrixcompensatie om spectrale overlapping tussen detectoren met kralen of met cellen16af te trekken.</li>
	<li>Neem 10.000 gebeurtenissen op voor de niet-bevlekte cellen en de enkele bevlekte kralen. Voor de fluorescentie minus één (FMO) controles, registreren 50.000 gebeurtenissen en voor de volledig bevlekte steekproeven registreren tot 100.000 gebeurtenissen. OPMERKING: Als alternatief kunnen enkele bevlekte monsters op de cellen worden uitgevoerd. Zorg er dan voor dat de cellen een positief signaal hebben voor de gewenste marker.</li>
	<li>Verkrijg een enkel gekleurd cel- of kraalmonster voor elke fluorofoor die in het experiment wordt gebruikt om de hoeveelheid spectrale overlapping te onthullen. Gebruik de compensatiemaker van het flowcytometrieapparaat om overloopwaarden te berekenen en de compensatiematrix toe te passen op alle gemeten monsters. OPMERKING: Secundaire antilichamen kunnen niet worden gebruikt voor het maken van compensatie met kralen als de compensatie wordt berekend met kralen. Afhankelijk van het type compensatieparels kunnen secundaire antilichamen niet worden gebruikt voor de compensatie met kralen.</li>
	<li>Voor de FMO-controles en de volledige bevlekte monsters met het fusie-eiwit selecteert u eerst de cellen op basis van hun voorwaartse spreiding (FSC) en zijstrooiing (SSC). Na de uitsluiting van doubletten, poort de cellen op basis van hun negativiteit voor 7-AAD (PercP-Cy5.5) signaal om de dode cellen uit te sluiten (zie stap 5.15). De laatste plot toont de expressie van CD34 (Y-as) en NKG2DL (X-as) op levende singlets.</li>
	<li>Voor de enkele anti-NKG2DL-antilichamen, pas dezelfde strategie toe op de monsters, maar merk op dat ligand positiviteit ligt in Alexa Fluor 488 en niet in het PE-kanaal.</li>
	<li>Pas poorten aan volgens de FMO-besturingselementen voor gatingstrategie uit stap 6.4 en 6.5 (zie tabel 3) voor geschikte FMO-besturingselementen om voor dit experiment uit te voeren: Teken in de analysesoftware een poort op de negatieve fractie. Tijdens het opnemen van het volledig bevlekte monster zijn de cellen boven de eerder gemaakte poort positief voor de geanalyseerde markering.</li>
</ol>

<ol><li>Topham, N. J., Hewitt, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell+cytotoxicity%3A+how+do+they+pull+the+trigger%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger.</a> Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).</li>
<li>Campbell, K. S., Hasegawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell+biology%3A+an+update+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell biology: an update and future directions.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (3), 536-544 (2013).</li>
<li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+or+adaptive+immunity%3F+The+example+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331 (6013), 44-49 (2011).</li>
<li>Wensveen, F. M., Jelenčić, V., Polić, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKG2D%3A+A+master+regulator+of+immune+cell+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">NKG2D: A master regulator of immune cell responsiveness.</a> Frontiers in Immunology. 9, 441(2018).</li>
<li>Zingoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKG2D+and+its+ligands%3A+%22One+for+All%2C+All+for+One%22%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">NKG2D and its ligands: "One for All, All for One".</a> Frontiers in Immunology. 9, 476(2018).</li>
<li>Eagle, R. A., Trowsdale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuity+and+the+single+receptor%3A+NKG2D%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Promiscuity and the single receptor: NKG2D.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 737-744 (2007).</li>
<li>El-Gazzar, A., Groh, V., Spies, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+and+conflicting+roles+of+the+human+NKG2D+lymphocyte+receptor+and+its+ligands+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunobiology and conflicting roles of the human NKG2D lymphocyte receptor and its ligands in cancer.</a> Journal of Immunology. 191 (4), 1509-1515 (2013).</li>
<li>Venkataraman, G. M., Suciu, D., Groh, V., Boss, J. M., Spies, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter+region+architecture+and+transcriptional+regulation+of+the+genes+for+the+MHC+class+I-related+chain+A+and+B+ligands+of+NKG2D%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Promoter region architecture and transcriptional regulation of the genes for the MHC class I-related chain A and B ligands of NKG2D.</a> Journal of Immunology. 178 (2), 961-969 (2007).</li>
<li>Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+signaling+by+inhibitory+receptors%3A+the+NK+cell+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Negative signaling by inhibitory receptors: the NK cell paradigm.</a> Immunological Reviews. 224, 70-84 (2008).</li>
<li>Hüe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+role+for+NKG2D%2FMICA+interaction+in+villous+atrophy+during+celiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease.</a> Immunity. 21 (3), 367-377 (2004).</li>
<li>Gasser, S., Raulet, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+self-tolerance+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Activation and self-tolerance of natural killer cells.</a> Immunological Reviews. 214, 130-142 (2006).</li>
<li>Groh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+stress-regulated+human+major+histocompatibility+complex+class+I+gene+expressed+in+gastrointestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12445-12450 (1996).</li>
<li>Maurer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-mediated+shedding+of+NKG2D+ligands+impairs+NK+cell+immune-surveillance+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Platelet-mediated shedding of NKG2D ligands impairs NK cell immune-surveillance of tumor cells.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1364827(2018).</li>
<li>Paczulla, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+NKG2D+ligands+defines+leukaemia+stem+cells+and+mediates+their+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Absence of NKG2D ligands defines leukaemia stem cells and mediates their immune evasion.</a> Nature. 572 (7768), 254-259 (2019).</li>
<li>Paczulla, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+observation+reveals+high-frequency+engraftment+of+human+acute+myeloid+leukemia+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Long-term observation reveals high-frequency engraftment of human acute myeloid leukemia in immunodeficient mice.</a> Haematologica. 102 (5), 854-864 (2017).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).</li>
<li>Bonnet, D., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+acute+myeloid+leukemia+is+organized+as+a+hierarchy+that+originates+from+a+primitive+hematopoietic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.</a> Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).</li>
<li>Taussig, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-initiating+cells+from+some+acute+myeloid+leukemia+patients+with+mutated+nucleophosmin+reside+in+the+CD34%28-%29+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukemia-initiating cells from some acute myeloid leukemia patients with mutated nucleophosmin reside in the CD34(-) fraction.</a> Blood. 115 (10), 1976-1984 (2010).</li>
<li>Zhou, J., Chng, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+targeting+leukemia+stem+cells%3A+the+path+to+the+cure+for+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification and targeting leukemia stem cells: the path to the cure for acute myeloid leukemia.</a> World Journal of Stem Cells. 6 (4), 473-484 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Hier presenteren we twee flow cytometrische methoden die NKG2DL-oppervlakteexpressie op menselijke primaire AML-cellen kunnen detecteren. We laten zien dat beide detectiemethoden kunnen worden gebruikt in combinatie met andere antilichaamkleuringen (bijv. het detecteren van CD34-expressie). Vergelijkbare kleuringen kunnen ook worden uitgevoerd op andere primaire celtypen en cellijnen.
We hebben onlangs laten zien dat de afwezigheid van NKG2DL op het oppervlak van AML-patiëntstralen LSC<sup cla...

NK-cellen zijn belangrijke effectoren van het aangeboren immuunsysteem die kwaadaardige cellen of gestreste gezonde cellen (bijv. door een virale infectie) kunnen herkennen en elimineren zonder voorafgaande antigeenstimulatie1. Dit proces wordt strak gereguleerd via een complex repertoire van activerende receptoren (zoals natuurlijke cytotoxiciteitsreceptoren (NVR's), NKG2D en CD16) en remmende receptoren die grotendeels worden vertegenwoordigd door killer immunoglobuline-achtige receptoren (KIR's)2. Binding van KIR's aan humane leukocytenantigeen (HLA) klasse I moleculen op somatische cellen zorgt voor zelfherkenning en brengt NK celtolerantie over. Aan de andere kant veroorzaken afwezigheid van zelfherkenning en verhoogde binding van activerende receptoren aan hun liganden op de doelcellen de afgifte van cytotoxische korrels die leiden tot NK-celgemedieerde cytotoxiciteit1. Ten slotte kunnen NK-cellen antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit (ADCC) uitoefenen door de activerende receptor CD16 te binden aan doelen die het Fc-gedeelte van Ig (FcR)uitdrukken 2. Afgezien van directe cytotoxiciteit kunnen NK-cellen ook cytokine-afgifte activeren die de aangeboren stof overbrugt met het adaptieve immuunsysteem3.
NKG2D is een belangrijke activerende receptor uitgedrukt op NK, NKT, γδ T en naïeve CD8+ T-cellen4 die dergelijke cytotoxische immuuncellen in staat stelt om NKG2D ligand (NKG2DL) te herkennen en te lyseren en doelcellen uit te drukken. Gezonde cellen drukken NKG2DL vaak niet uit. In plaats daarvan wordt de NKG2DL-expressie geherreguleerd op kwaadaardige of met virussen geïnfecteerde cellen om deze vatbaar te maken voor immuunklaring5.
De menselijke NKG2DL-familie bestaat uit acht bekende moleculen waaronder de twee MHC I-ketengerelateerde moleculen A en B (MICA en MICB6) en het cytomegalovirus UL16-bindende eiwitten 1–6 (ULBP1-67). De expressie van NKG2DL is gereguleerd op de transcriptie, post-transcriptionele en de post-translationele niveaus8. Als zodanig, terwijl NKG2DL-expressie meestal niet detecteerbaar is op het oppervlak van gezonde cellen, werden NKG2DL mRNA9 en intracellulaire eiwitexpressie gerapporteerd in gezonde weefsels. De functionele relevantie van een dergelijke expressie en de mechanismen die aan dergelijke discrepante expressiepatronen ten grondslag liggen , moeten nog worden gedefinieerd10.
De mechanistische regulatie van NKG2DL expressie in de kankercellen is een fascinerend onderzoeksgebied. Trajecten waarvan bekend is dat ze betrokken zijn bij cellulaire stress, bijvoorbeeld de hitteschokstressroute9, of DNA-schadegerelateerde paden, zoals de ataxie telangiectasia gemuteerde (ATM) en Rad3-gerelateerde (ATR) route11, evenals virale of bacteriële infecties zijn direct gekoppeld aan de inductie van NKG2DL-expressie12. Echter, zelfs als oppervlakte expressie van NKG2DL effectief is geïnduceerd, kan deze expressie opnieuw verloren gaan door proteolytisch-gemedieerde afwerping, een mechanisme geassocieerd met immuunontsnapping en slechte klinische prognose bij sommige kankers13.
De afwezigheid van celoppervlak NKG2DL kan ook een belangrijke rol spelen bij patiënten met AML. Hier veroorzaakt behandeling met intensieve chemotherapie vaak remissie, maar terugval treedt vaak op door leukemische stamcellen (LSC), die selectief chemotherapieën overleven en immuunrespons ontwijken. Zoals we onlangs hebben laten zien, ontsnappen LSC's bijvoorbeeld aan NK-cellysis door NKG2DL-oppervlakteexpressie14 teonderdrukken.
Omgekeerd kan de afwezigheid van oppervlakte NKG2DL-expressie worden gebruikt als een methode om putatieve stamachtige subpopulaties van cellen te identificeren en viably te isoleren van bulk tegenhanger leukemische subpopulaties. Hier presenteren we twee flow cytometrische benaderingen die kunnen worden gebruikt om NKG2DL-oppervlakteexpressie te detecteren en daarmee NKG2DL-negatieve stamcellen bij leukemie en misschien ook bij andere kankers te identificeren: een methode voor pan-ligand oppervlakteherkenning en een methode waarbij kleuring met enkele of gepoolde antilichamen individuele bekende NKG2DL-eiwitten herkent.

<table><tbody><tr><td>7-amminoactinomycin D (7-AAD)</td><td>Invitrogen</td><td>A1310</td><td>Viability dye</td></tr><tr><td>96 well plate U bottom</td><td>Sarstedt</td><td>833925500</td><td>96 Well plate voor onze Flow cytometer</td></tr><tr><td>APC Mouse Anti-Human cd34</td><td>BD</td><td>555824</td><td>Antilichaam dat CD34 detecteert RRID: AB_398614</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1391,0050</td><td>Onderdeel van de kleuring buffer</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Roth</td><td>8043.1</td><td>Onderdeel van de kleuring buffer</td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FCS)</td><td>BioConcept</td><td>2-01F10-I</td><td>Onderdeel van het aangevulde RPMI medium</td></tr><tr><td>FlowJo 10.2</td><td>BD</td><td>/</td><td>Software die gegevensanalyse mogelijk maakt voor flowcytometrie experiment</td></tr><tr><td>Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21222</td><td>Secundair antilichaam dat de primaire antilichamen voor MICA en MICB detecteert RRID: AB_1037853</td></tr><tr><td>Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF</td><td>R&amp;D</td><td>1299-NK-050</td><td>Fusion eiwit dat alle NKG2DLs detecteert RRID:</td></tr><tr><td>Human ULBP-1 Antibody</td><td>R&amp;D</td><td>AF1380</td><td>Antilichaam dat ULBP1 detecteert RRID: AB_354765</td></tr><tr><td>Human ULBP-2/5/6 Antibody</td><td>R&amp;D</td><td>AF1298</td><td>Antilichaam dat ULBP2/5/6 detecteert RRID: AB_354725</td></tr><tr><td>Human ULBP-3 Antibody</td><td>R&amp;D</td><td>AF1517</td><td>Antilichaam dat ULBP3 detecteert RRID: AB_354835</td></tr><tr><td>MICA Polyclonal Antibody</td><td>Thermo Scientific</td><td>PA5-35346</td><td>Antilichaam dat MICA detecteert RRID: AB_2552656</td></tr><tr><td>MICB Polyclonal Antibody</td><td>Thermo Scientific</td><td>PA5-66698</td><td>Antilichaam dat MICB detecteert RRID: AB_2663413</td></tr><tr><td>One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions</td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-093-385</td><td>Biotinyleringskit voor het NKG2DL fusie-eiwit</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>Onderdeel van de kleuring buffer</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11034</td><td>Secundair antilichaam dat de primaire antilichamen voor de ULBPs detecteert RRID: AB_2576217</td></tr><tr><td>Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um</td><td>Spherotech Inc.</td><td>RCP-30-20A</td><td>Beads gebruikt voor het onderhoud van flowcytometrieapparatuur</td></tr><tr><td>RPMI medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8758-500ML</td><td>Celcultuur medium</td></tr><tr><td>RayBright Universal Compensation Beads</td><td>Raybiotech</td><td>137-00013-100</td><td>Beads gebruikt om de compensatiematrix te maken</td></tr><tr><td>Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL</td><td>Invitrogen</td><td>S866</td><td>Tweede stap voor de detectie van het gebiotinyleerde NKG2DL fusie-eiwit</td></tr></tbody></table>

twee flow cytometrische benaderingen van nkg2d ligand-oppervlaktedetectie om stamcellen te onderscheiden van bulksubpopulaties bij acute myeloïde leukemie

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Bij dezelfde patiënt bleek de afwezigheid van NKG2D liganden (NKG2DL) oppervlakteexpressie leukemische subpopulaties met stamceleigenschappen (zogenaamde leukemische stamcellen, LSC's) te onderscheiden van meer gedifferentieerde tegenhanger leukemische cellen die geen ziekte-initiatiepotentieel hebben, hoewel ze vergelijkbare leukemiespecifieke genetische mutaties dragen. NKG2DL zijn biochemisch zeer diverse MHC klasse I-achtige zelfmoleculen. Gezonde cellen in homeostatische omstandigheden drukken over het algemeen geen NKG2DL uit op het celoppervlak. In plaats daarvan wordt de expressie van deze liganden geïnduceerd bij blootstelling aan cellulaire stress (bijv. oncogene transformatie of infectieuze stimuli) om eliminatie van beschadigde cellen via lysis te activeren via NKG2D-receptor-expresserende immuuncellen zoals nk-cellen (natural killer). Interessant is dat NKG2DL-oppervlakteexpressie selectief wordt onderdrukt in LSC-subpopulaties, waardoor deze cellen NKG2D-gemedieerde immuunbewaking kunnen ontwijken. Hier presenteren we een zij-aan-zij analyse van twee verschillende flowcytometriemethoden die het mogelijk maken om NKG2DL-oppervlakteexpressie op kankercellen te onderzoeken, d.w.z. een methode met pan-ligandherkenning en een methode waarbij meerdere antilichamen tegen enkelvoudige liganden worden gekleurd. Deze methoden kunnen worden gebruikt om levensvatbare NKG2DL-negatieve cellulaire subpopulaties te scheiden met putatieve kankerstamceleigenschappen van NKG2DL-positieve niet-LSC.

Beide hier gepresenteerde protocollen maken de verrijking van AML LSC door flow cytometrische analyses mogelijk met behulp van CD34, een bekende marker van LSC17, in combinatie met NKG2DL-oppervlakteexpressie door gebruik te maken van pan-ligandherkenning of kleuring met gepoolde antilichamen tegen individuele liganden. In figuur 1laten we zien dat de geanalyseerde AML-monsters positief zijn voor CD34 en NKG2DL, maar er bestaan ook negatieve subpopulaties, wat wordt a...

We presenteren twee verschillende kleuringsprotocollen voor NKG2D ligand (NKG2DL) detectie in menselijke primaire acute myeloïde leukemie (AML) monsters. De eerste benadering is gebaseerd op een fusie-eiwit, in staat om alle bekende en potentieel nog onbekende liganden te herkennen, terwijl het tweede protocol afhankelijk is van de toevoeging van meerdere anti-NKG2DL-antilichamen.

Twee flow cytometrische benaderingen van NKG2D Ligand-oppervlaktedetectie om stamcellen te onderscheiden van bulksubpopulaties bij acute myeloïde leukemie

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Dit protocol toont twee verschillende manieren om NKG2DLs op het oppervlak van AML-cellen te detecteren. De techniek biedt een snelle, gebruiksvriendelijke kleurmethode om alle bekende en mogelijk onbekende NKG2DLs te detecteren. Deze methode maakt het mogelijk om leukemische stamcellen te scheiden van bulk AML-cellen, waardoor het mogelijk is om deze cellen verder te karakteriseren.Begin met het ontdooien van de biotine en de NKG2D fusie-eiwitbuizen op kamertemperatuur. Draai snel het NKG2D FC-poeder naar beneden en voeg vervolgens 500 microliters PBS toe om het poeder te reconstrueren en meng grondig met een P-1000 micropipet. Voeg 100 microliter van het NKG2DL-fusie-eiwit toe aan een biotinebuis om een eindconcentratie van 10 microgram per milliliter te verkrijgen en meng de oplossing grondig met een P-100 micropipet.Om de AML-cellen te ontdooien, verwijdert u de cryovial bevattende primaire AML uit de vloeibare stikstofopslag en plaatst u deze onmiddellijk in een waterbad van 37 graden Celsius. Beweeg de buis voorzichtig heen en weer in het water, zodat de inhoud van de flacon kan ontdooien totdat er nog maar een klein ijskristal over is. Breng de ontdooide cellen onmiddellijk over in het medium met buis en spoel de flacon af met één milliliter medium.Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten op 300 maal G en gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren. Was de cellen met vijf milliliter RPMI-medium met 10% FCS en herhaal de centrifugeer. Resuspendeer de celkorrel met kleuringsbuffer tot een eindconcentratie van 0,5 maal 10 tot de zevende cel per milliliter.Breng vervolgens 100 microliters van de celsuspensie over naar een celkweek 96 put U-bodemplaat en centrifugeer de plaat gedurende 10 minuten op 300 keer G. Gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren. Bereid een mastermix van biotinylated NKG2D fusie-eiwit voor, zodat de cellen worden geresuspendeerd in een eindvolume van 50 microliter per put met een uiteindelijke NKG2D-concentratie van 10 microgram per milliliter per put.Voeg de bereide mastermix toe en resuspendeer de celkorrels met een pipet van 200 microliter. Incubeer en centrifugeer de plaat zoals beschreven in het teksthandschrift. Bereid een mastermix voor met streptavidin PE, zodat de cellen worden geresuspendeerd in een eindvolume van 50 microliter.Voeg de mastermix toe aan de cellen en resuspend de pellets met een 300 microliter meerkanaals pipet. Gebruik na het centrifugeren van de plaat en het weggooien van het supernatant een 300 microliter meerkanaals micropipet om de celkorrels opnieuw te gebruiken in 200 microliters kleurbuffer plus 7-AAD. Analyseer vervolgens de cellen met behulp van een flowcytometrieapparaat.De geanalyseerde AML-monsters zijn positief voor CD34 en NKG2DL, maar er bestaan ook negatieve subpopulaties, met in totaal vier verschillende populaties. De typische gatingstrategie begint met de selectie van de belangrijkste populatie cellen via hun FSC en SSC. Doubletten en dode cellen zijn uitgesloten in de downstream analyse.De poorten worden aangepast met behulp van FMO-controles om een goede identificatie van positieve cellen te garanderen. De fluorescentieintensiteiten van cellen die positief zijn voor CD34 versus NKG2DL worden hier benadrukt. AML-cellen die positief zijn voor CD34 vertonen een lagere oppervlakte-expressie van NKG2DL, wat aangeeft dat NKG2DL-expressie geassocieerd is met een gebrek aan steelheid.Drie primaire AML-monsters toonden 19,8, 49,8 en 89,4% positieve voorvallen voor de fusie-eiwitkleuring versus 20,4, 50,4 en 90,6% voor de gepoolde anti-NKG2DL-antilichaamkleuring. Aan de andere kant vertoonde enkele ligandkleuring een reeks positieve gebeurtenissen tot 92%, waarbij de percentages varieerden op basis van de ligand. Bij het proberen van deze methode is het erg belangrijk om snel te zijn bij het ontdooien van de primaire AML-cellen, omdat ze fragiel zijn en gemakkelijk kunnen sterven tijdens deze stap.Na het uitvoeren van dit protocol kan een celsortering op basis van het NKG2DL-signaal worden uitgevoerd om de populaties verder te onderzoeken.

two-flow-cytometric-approaches-nkg2d-ligand-surface-detection-to

Research

JoVE Journal

Cancer Research

We bieden een gedetailleerde beschrijving van een protocol voor flowcytometrische analyse van oppervlakte-antigenen en/of intracellulaire antigenen in neurale celtypen. Kritische aspecten van experimentele planning, stap-voor-stap methodologische procedures en fundamentele principes van flowcytometrie worden uitgelegd om neurobiologen in staat te stellen deze krachtige technologie te benutten.

Flowcytometrie Protocollen voor Surface en intracellulaire Antigen Analyses van Neural Cell Types

Een eenvoudige en betrouwbare werkwijze is beschreven om een ​​set van NK celfuncties zoals degranulatie cytokine en chemokine productie in verschillende NK cel subsets te analyseren.

Flowcytometrie-gebaseerde test voor het toezicht op NK celfuncties

Een stroom cytometry gebaseerde methode om kwantitatief de cytotoxische activiteit van menselijke natural killer cellen wordt hier weergegeven.

Een stroom Cytometry gebaseerde cytotoxiciteit Assay voor de beoordeling van menselijke NK cel activiteit

Detectie van minimale of meetbare residuele ziekte (MRD) is een belangrijke voorspellende biomarker voor risico-evaluatie te verfijnen en het voorspellen van herval in acute myeloïde leukemie (AML). Deze uitgebreide richtlijnen en aanbevelingen met de best practices voor consistente en accurate identificatie en opsporing van MRD, kan steun bij het maken van effectieve AML behandelingsbeslissingen.

Uitgebreide Protocol bij monster en proces beenmerg voor het meten van meetbare residuele ziekte en leukemische cellen van de stam in Acute myeloïde leukemie

Duidelijk naar voren komt een protocol voor het detecteren van gelijktijdige uitdrukking van leukemie stamcel merkers op primaire acute myeloïde leukemie cellen door stroom cytometry. We laten zien hoe te kwantificeren drie voorlopercellen populaties en een vermeende LSC bevolking met de toenemende mate van rijping. We hebben bevestigd dat de aanwezigheid van deze populaties in overeenkomstige patiënt-afgeleid-xenografts.

Stroom Cytometry om te schatten leukemie cellen van de stam in primaire Acute myeloïde leukemie en patiënt-afgeleid-xenografts, bij diagnose en Follow Up

Hier presenteren we een stroom cytometrische protocol ter identificatie van CD4+ en CD8+ T cellen en γδ T cellen, B-cellen, NK-cellen, monocyten in perifere bloed met behulp van slechts twee fluorochromes in plaats van zeven. Met deze aanpak, kunnen vijf extra markeringen op de meeste flow cytometers worden opgeslagen.

Discriminatie van zeven immuun cel deelverzamelingen door twee-fluorescerende Stroom Cytometry

We beschrijven een methode voor het gebruik van Multi parameter flow cytometrie te detecteren mitochondriale reactieve zuurstof soorten (ROS) in Murine gezonde hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPCs) en leukemie cellen van een muismodel van acute myeloïde leukemie (AML) gedreven door MLL-AF9.

Flow cytometrische analyse van mitochondriale reactieve zuurstof soorten in Muriene hematopoietische stam en voorlopercellen en MLL-AF9 gedreven leukemie

Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd om micro-omgevingspopulaties in het beenmerg te isoleren en te karakteriseren op basis van muizenmodellen van myelodysplastische syndromen en acute myeloïde leukemie. Deze techniek identificeert veranderingen in de niet-hematopoëtische beenmergniche, inclusief de endotheliale en mesenchymale stromale cellen, met ziekteprogressie.

Identificatie van micro-omgevingspopulaties in het beenmerg bij myelodysplastisch syndroom en acute myeloïde leukemie

Hier wordt een op fosfoflowcytometrie gebaseerde methode beschreven om de signalering stroomafwaarts van de mTORC1-, JAK/STAT5- en MAPK-routes te analyseren in acute menselijke myeloïde leukemiecellen die xenotransplanteerd zijn in muizen en verkregen uit beenmergaspiraten. p-STAT5-, p-4EBP1-, p-RPS6- en p-ERK1/2-niveaus worden tegelijkertijd gemeten met behulp van een spectrale flowcytometer van de volgende generatie met hoge gevoeligheid.

Intracellulaire fosfoflowcytometrie van acute myeloïde leukemie Patiënt-afgeleide xenotransplantaties

Dit protocol beschrijft het gebruik van centrifugaal elutriation te scheiden van primaire acute lymfatische leukemie cellen in verschillende celcyclus fasen.

Voorbereiding van primaire Acute lymfatische leukemie cellen in verschillende celcyclus fasen door centrifugaal Elutriation

Leer twee flow cytometrische methoden om NKG2D liganden te detecteren op acute myeloïde leukemiecellen. Deze technieken scheiden leukemische stamcellen van bulkpopulaties voor verdere karakterisering.

Twee flow cytometrische benaderingen van NKG2D Ligand-oppervlaktedetectie om stamcellen te onderscheiden van bulksubpopulaties bij acute myeloïde leukemie (Video) | JoVE Journal

Twee flow cytometrische benaderingen van NKG2D Ligand-oppervlaktedetectie om stamcellen te onderscheiden van bulksubpopulaties bij acute myeloïde leukemie

Meer video's verkennen