Name: Generatie, onderhoud en identificatie van kiemvrije zebravismodellen van larven tot juveniele stadia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: Leer hoe je kiemvrije zebravisembryo's genereert en onderhoudt van larve tot juveniel stadium. Deze methode maakt onderzoek naar gastheer-microbioom interacties en ontwikkeling mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken oprecht de steun van het Chongqing Medical University Talent Project (nr. R4014 tot DSP en R4020 tot PPJ), de National Natural Science Foundation of China (NSFC, nr. 32200386 tot PPJ), de Chongqing Postdoctoral Innovation Mentor Studio (X7928 DSP) en het programma van het China-Sri Lanka Joint Center for Water Technology Research and Demonstration door de Chinese Academie van Wetenschappen (CAS) / China-Sri Lanka Joint Center for Education and Research door CAS.

De visexperimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Animal Care and Use Committee van Chongqing en het Institutional Animal Care and Use Committee van de Chongqing Medical University, China, evenals de normen voor proefdieren uitgegeven door het State Bureau of Quality and Technical Supervision (goedkeurings-ID: GB14922-2001 tot GBT14927-2001). Zebravissen (Danio rerio, wildtype, AB-stam) waren afkomstig van het Instituut voor Hydrobiologie, Chinese Academie van Wetenschappen, en werden in het laboratorium onderhouden volgens eerder gerapporteerde procedures36.
1. Onderhoud van volwassen zebravissen en verzameling van embryo's
OPMERKING: Op basis van wijzigingen uit eerdere studies en rapporten 16,37,38,39 werd het onderhoud van volwassen zebravissen, het kweken van larven en praktijken voor kiemvrije (GF) modellen in ons laboratorium uitgevoerd volgens de onderstaande stappen. Het ultrazuivere stromingssysteem voor de viskweek werd commercieel verkregen (zie Materiaaltabel). Het water, dat wordt onderhouden met een uitgebalanceerde pH, zout en alkali, ondergaat tijdens het fietsen filtratie om schone omstandigheden te garanderen.
<ol><li>Onderhoud volwassen vissen volgens de volgende standaardprocedure in het autocyclussysteem (zie Materiaaltabel) met een fotoperiode van het donker: licht = 10 uur: 14 uur bij 28 °C ± 0,5 °C en gevoed met vers geïncubeerde Artemia sp. twee keer per dag.</li>
	<li>Zet de geslachtsrijpe volwassen zebravis (mannetje: vrouwtje = 2:1) de avond ervoor in bakken met vers en schoon water.</li>
	<li>Laat de vissen de volgende ochtend (ongeveer 8.30 uur) paaien onder regelmatige lichtstimulatie in het laboratorium. Breng de vis na 1-2 uur over naar een ander aquarium.</li>
	<li>Verzamel embryo's in water uit het auto-cycling-systeem als opfokmedium in een kweekschaaltje met behulp van een wegwerppasteurpipet.</li>
</ol>2. Generatie van GF-zebravissen van embryo's tot larven
OPMERKING: De procedure voor het genereren van kiemvrije (GF) vissen wordt beschreven in figuur 1, terwijl de basisontwikkelingsindexen van conventionele (CR) en GF-modellen worden weergegeven in aanvullende figuur 1. Volg de onderstaande stappen in een biologische veiligheidskast of laminaire stromingskap met behulp van een steriele aseptische techniek in een cleanroom.
<ol><li>Was de embryo's met het viskweekwater en verwijder de ontlasting, onzuiverheden en dode of onbevruchte eieren.</li>
	<li>Breng de embryo's over bij 2 hpf naar gesteriliseerde platen (tot 480 embryo's per steriel schaaltje met een diameter van 10 cm) gevuld met antibiotisch kiemvrij zebravismedium (AB-GZM, zie Materiaaltabel) oplossing en cultuur bij 28,5 °C gedurende 6-8 uur. OPMERKING: AB-GZM wordt gebruikt om de embryo's gedurende enkele uren te behandelen om de oppervlaktemicro-organismen te elimineren, en GZM zonder antibiotica wordt gebruikt om GF-vissen in subsequentie te kweken. Gewoonlijk is de geperfectioneerde kweektijd 6 uur).</li>
	<li>Sluit eieren met witte vlekken of een witachtig uiterlijk uit en selecteer eieren die normaal ontwikkeld zijn, met transparante en intacte enveloppen voor verdere verwerking.</li>
	<li>Spoel de embryo's binnen 10 minuten drie keer af met AB-GZM.</li>
	<li>Week de embryo's gedurende 1 minuut in 0,2 g/l povidonjodiumoplossing (PVP-I) (zie materiaaltabel). OPMERKING: Een hogere concentratie en langer dan 2 minuten heeft invloed op de sterfte en het uitkomen van embryo's.</li>
	<li>Was de embryo's binnen 10 minuten drie keer met kiemvrij zebravismedium (GZM).</li>
	<li>Voeg embryo's toe aan de werkoplossing van natriumhypochloriet (NaClO), bedek de microcentrifugebuisjes van 50 ml goed en bleekmiddel gedurende 15 minuten. Suspendeer gedurende deze periode de embryo's in bleekoplossing door ze voorzichtig te schudden.</li>
	<li>Was de embryo's drie keer met GZM binnen 10 minuten.</li>
	<li>Breng de embryo's over naar steriele platen met 6 putjes met 5 embryo's en 10 ml GZM per putje. Kweek ze in een ultraschoon platform of incubator met een fotoperiode van donker: licht = 10 uur: 14 uur bij 28 °C ± 0,5 °C. De kweekdichtheid heeft invloed op de steriele snelheid.</li>
	<li>Vernieuw het kweekmedium dagelijks door het verbruikte GZM te verwijderen, het als monsters te verzamelen voor steriele statusdetectie en elk putje aan te vullen met hetzelfde volume steriel GZM.</li>
	<li>Noteer de basisontwikkelingsindexen van GF-embryo's/larven, inclusief het overlevingspercentage, het uitkomstpercentage, de hartslag, de lichaamslengte en het gewicht, enz.19.</li>
	<li>Breng de GF-vissen over in geschikte containers (schalen, celkweekkolven of glazen flessen met deksels) met een groter volume, zodat er tijdens het groeiproces steriel voedsel ontstaat.</li>
</ol>3. Onderhoud van GF zebravissen van larve tot juveniel
<ol><li>Vernieuw de GZM zonder voeding vóór 7 dpf en detecteer dagelijks de steriele toestanden (zie stap 5).</li>
	<li>Voer zebravislarven van 8 dpf tot juveniele stadia eenmaal daags met steriel eigeel (10 μl bereide bouillonoplossing per putje) voordat u GZM vervangt.</li>
	<li>Voer GF-jongeren vanaf 14 dpf met gesteriliseerd eigeel gemengd met GF Artemia sp. eenmaal daags (1-3 Artemia/larven, zie stap 4), waarbij de voedselmassa geleidelijk toeneemt met de groei en ontwikkeling van GF-vissen.</li>
	<li>Geef de eidooier tot alle vissen Artemia nauplii kunnen consumeren. OPMERKING: GF Artemia moet voor gebruik een steriliteitstest ondergaan. Beoordeel het aantal Artemia nauplii dat nog over is, observeer de achtervolging en de voortgang van het vangen, en onderzoek het lichaam van de vis met geconsumeerd voedsel om het voedingssucces aan te geven.</li>
	<li>Van 28 dpf tot vroege volwassen stadia, GF Artemia eenmaal daags voeden (3-5 Artemia/larven) en onaangeboorde of dode Artemia en dode vissen in het afval GZM als dagelijkse monsters verwijderen.</li>
	<li>Vervang tijdens de groei van GF-vissen de 6-putjes platen na 7 dpf door steriele platen of celkweekkolven van 8 naar 21 dpf en vervolgens door steriele flessen na 21 dpf. Verhoog het kweekmedium en de voedselmassa volgens het aantal en het gewicht van GF-vissen in elke container.</li>
	<li>Vernieuw GZM dagelijks en controleer monsters om het succes van GF-modellen te garanderen. OPMERKING: Het handhaven van kiemvrije (GF) vismodellen tot de vroege volwassenheid en geslachtsrijpheid is een uitdaging, met een laag gemiddeld overlevingspercentage van 30 dpf, meestal minder dan 10%. Dit wordt voornamelijk toegeschreven aan een zwakke immuniteit, vertraagde ontwikkeling en een verminderde darmfunctie.</li>
</ol>4. Bereiding van GF Artemia nauplii als steriel voer voor chronische GF vismodellen
OPMERKING: De teelt- en bereidingswijze van kiemvrije (GF) Artemia is weergegeven in figuur 2. Merk op dat alle volgende stappen worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast, met behulp van een steriele aseptische techniek.
<ol><li>Spoel 0,25 g Artemia-cysten af met 2,4 g/l natriumhypochloriet (NaClO, zie materiaaltabel) gedurende 5 min.</li>
	<li>Filter de gespoelde Artemia-cysten met een gesteriliseerd ultradicht filter (ongeveer 170 mazen in de opening) en was drie keer met gesteriliseerd ultrapuur water, elke keer gedurende 1-2 minuten.</li>
	<li>Breng de gewassen Artemia-cysten over in 100 ml 2,5% gesteriliseerd zout water, meng en verpak voor aseptisch uitkomen volgens de onderstaande stappen.</li>
	<li>Verpak de 50 ml behandelde Artemia cysten mengseloplossing in een steriele fles met een inhoud van 100 ml, sluit deze af met folie en incubeer in een schudincubator bij 150 rpm, 30 °C gedurende 18 uur tot 24 uur met licht.</li>
	<li>Extraheer ongeveer 30 ml uitkomende Artemia-naupliën uit de middelste en onderste lagen met behulp van een pasteurpipet voor eenmalig gebruik. OPMERKING: Voorkom dat drijvende eieren en lege schalen de bovenste laag bereiken. De indexen van kiemvrije (GF) Artemia-cysten en nauplii die gedurende 24 uur zijn geïncubeerd, worden weergegeven in figuur 3.</li>
	<li>Filtreer de Artemia met een sterilisatiefilter en was ze drie keer in een sterilisatiebeker met steriliserend ultrapuur water, telkens ongeveer 30 s tot 1 min. Voeg ten slotte 4 ml gesteriliseerd ultrapuur water toe om de Artemia gemengde oplossing te bereiden.</li>
	<li>Haal met een wegwerppasteurpipet actief zwemmende Artemia uit de bovenste laag, was en bereid de nauplii-oplossing voor voor voeding en aseptische identificatie.</li>
</ol>5. Identificatie van GF-vismodellen in de gehele levensfase
OPMERKING: Gedurende de gehele levensfasen van kiemvrije (GF) vissen zijn sleutelindexen en dagelijkse monsterdetecties van cruciaal belang om het succes van de modellen te garanderen. In deze stap wordt een overzicht gegeven van de gebruikelijke classificatie van monsters en de gebruikelijke identificatiemethoden (figuur 4).
<ol><li>Observeer en tel dagelijks de overlevingsstatus en snelheid van GF-zebravislarven. In experimenten die gerelateerde snelheden berekenen, worden GF-vissen gekweekt in platen met 24 of 48 putjes met één vis per put.<ol><li>Overlevingspercentage = (aantal levende vissen op het moment van observatie / totaal aantal eieren) × 100%.</li>
		<li>Steriliteitspercentage = (aantal steriele vissen/aantal overlevende vissen) × 100%. OPMERKING: Dit protocol richt zich op de steriele snelheid van levende vissen. Het aantal steriele vissen wordt bepaald door succesvolle GF-vissen te tellen na meerdere controles onder de levende vissen. Alle dode vissen of levende vis GF-modellen die zijn mislukt vanwege de aanwezigheid van bacteriën, worden geëlimineerd tijdens daaropvolgende GF-procedures.</li>
	</ol></li>
	<li>Verzamel de volgende monsters van GF-zebravislarven.<ol><li>Kweekmedium van GF-zebravis uit elke put of flescontainer.</li>
		<li>Visvoer, zoals steriel eigeel en GF Artemia.</li>
		<li>Afvalmedium, met inbegrip van fragmenten van het eimembraan na het uitkomen en voedselresten of uitwerpselen tijdens de foerageerperioden van larven tot jonge vissen.</li>
		<li>Dode vismonsters om de aanwezigheid van bacteriën te identificeren.</li>
		<li>Vismedium en middelen die worden gebruikt bij de behandeling van embryo's als steriele controle.</li>
		<li>Monsters van materialen, bedieningsplatform en incubator, enz.</li>
	</ol></li>
	<li>Detecteer monsters die dagelijks zijn verzameld met behulp van meerdere methoden.<ol><li>Gebruik eerst de smeerplaatmethode en kweekplaten in een incubator bij 30 °C.<ol><li>Smeer in met 20-50 μL afvalmediummonster op de Trypticase Soy Agar (TSA)-plaat (zie Materiaaltabel) onder aërobe omstandigheden.</li>
			<li>Smeer met 20-50 μL afvalmediummonster op de TSA-plaat onder anaërobe omstandigheden.</li>
			<li>Smeer in met 20-50 μL afvalmediummonster op de TSA-bloedplaten (zie materiaaltabel) onder aërobe omstandigheden.</li>
			<li>Smeer met 20-50 μL afvalmediummonster op de bloed-TSA-platen onder anaërobe omstandigheden.</li>
		</ol></li>
		<li>Ten tweede, gebruik de vloeibare cultuurmethode.<ol><li>Neem 200 μL monster in aërobe buizen met Brain Heart Infusion Broth (BHI) medium (zie Materiaaltabel) en kweek in de schudincubator bij 30 °C, 150-180 tpm.</li>
			<li>Voeg 200 μL monster toe aan anaërobe buizen met BHI-medium en kweek in de incubator bij 30 °C.</li>
			<li>Voeg 200 μL monster toe aan aërobe buizen met Trypticase sojabouillon (TSB) medium en kweek vervolgens in de schudincubator bij 30 °C, 150-180 tpm.</li>
			<li>Voeg 200 μL monster toe aan anaërobe buizen met TSB-medium en kweek in de incubator bij 30 °C.</li>
		</ol></li>
		<li>Ten derde, gebruik moleculaire technieken-16s polymerasekettingreactie (PCR) -assay.<ol><li>Analyseer het afvalwatermonster met twee paar primers 27F en 1492R, evenals 63F en 1387R (tabel 1). OPMERKING: De PCR-mastermix is bereid volgens Tabel 2 met behulp van een in de handel verkrijgbare DNA-polymerasekit (zie Materiaaltabel) en de PCR-machine is ingesteld met het programma gespecificeerd in Tabel 3.</li>
			<li>Nadat het PCR-programma is voltooid, onderzoekt u de producten met 1% agarosegelelektroforese40 op doelbanden van 1465 bp (met behulp van primers 27F en 1492R) of 1324 bp (met behulp van primers 63F en 1387R) om de steriliteit van monsters af te leiden.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Registreer en observeer steriliteitstests, inclusief plaat- en mediumcultuur van 24 uur tot 3 dagen en 7 dagen, waarbij geen kolonie op platen en geen troebelheid in vloeistof wijzen op de succesvolle constructie van GF-modellen. Observeer en noteer de plaat en het medium na 24 uur, 48 uur, 72 uur, 96 uur, 120 uur, 144 uur en 168 uur.</li>
</ol>6. Identificatie van GF Artemia-monsters voordat ze zich voeden met GF-vissen
OPMERKING: Volg de onderstaande stappen om de GF Artemia-monsters te detecteren, die onmisbaar zijn als levend voer voordat u zich voedt met GF-vissen (Figuur 4).
<ol><li>Verzamel monsters van GF Artemia-modellen .<ol><li>Onbehandelde Artemia-cysten .</li>
		<li>Behandelde GF Artemia cysten.</li>
		<li>Uitgekomen GF Artemia nauplii.</li>
		<li>Gesteriliseerd ultrapuur water als controle.</li>
	</ol></li>
	<li>Detecteer GF Artemia met de volgende methoden.<ol><li>Gebruik de spread-plaatmethode om de monsters te detecteren door ze onder aërobe en anaërobe omstandigheden op TSA-platen en bloed-TSA-platen te coaten. Incubeer ze bij 30 °C.</li>
		<li>Gebruik een vloeibaar medium om de monsters in aërobe en anaërobe TSB- en BHI-buizen te detecteren. Cultuur in een shaker bij 150-180 tpm, 30 °C.</li>
		<li>Gebruik PCR-assay om de aanwezigheid van bacteriën te detecteren in de monsters die zijn verzameld met behulp van 16s ribosomale RNA-doelgenen primers 27F en 1492R, 63F en 1387R (tabel 1). Het volume en het programma worden weergegeven in tabel 2 en tabel 3.</li>
	</ol></li>
	<li>Noteer de resultaten: Detecteer het PCR-product door 1% agarosegelelektroforese40 voor doelbanden van 1465 bp (met behulp van primers 27F en 1492R) of 1324 bp (met behulp van primers 63F en 1387R). De resultaten van platen en vloeibaar medium kunnen de steriele status van GF Artemia garanderen voordat het als GF-visvoer wordt gebruikt.</li>
</ol>7. Isolatie en identificatie van intestinale bacteriestammen van zebravissen
OPMERKING: Om darmfuncties in vitro en in vivo te onderzoeken, is het noodzakelijk om bacteriestammen van zebravissen te isoleren, die ook de soortbron vormen voor potentiële probiotica die worden gescreend door infectie met behulp van GF-dieren (Figuur 5). In dit protocol beschrijven we de traditionele dissectiemethode om darminhoud te verkrijgen, terwijl de monsters ook rechtstreeks van levende verdoofde vissen kunnen worden verzameld (gegevens niet getoond).
<ol><li>Kies gezonde volwassen zebravissen en was ze met steriel water. Voer de volgende stappen uit in de schone bank.</li>
	<li>Verdoof de vissen met 100 mg/L MS-222 gedurende 5-10 minuten.</li>
	<li>Gebruik 75% alcohol om het lichaamsoppervlak van de vis te behandelen.</li>
	<li>Ontleed de darmen van de vis en extrudeer de darminhoud met TSB- of BHI-medium.</li>
	<li>Incubeer het darmsupernatans door TSA, bloedplaat, TSB en BHI-medium in aërobe en anaërobe omstandigheden aan te brengen.</li>
	<li>Vertaal de bacteriën om de signaalspanning te krijgen en de kenmerken van verschillende kolonies vast te leggen.</li>
	<li>Bewaar de bacteriën binnen 30% glycerol bij -80 °C.</li>
	<li>Identificeer vervolgens de darmbacteriën door middel van genomische DNA-extractie en PCR-sequencing. OPMERKING: De belangrijkste stappen van bacteriële genomische DNA-extractie zijn vloeistofcentrifugatie, RNase A- en Protease K-dissociatie, ethylalcoholextractie, spoelen en oplossen met behulp van in de handel verkrijgbare kits volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Analyseer de 16S-sequenties met behulp van het National Center for Biotechnology Information (NCBI) en de Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) met de Bacteria and Archaea-database40,41 (zie Tabel met materialen).</li>
	<li>Kies de best overeenkomende bacteriën en karakters om de geïsoleerde darmstammen op genusniveau te identificeren.</li>
	<li>Detecteer de metabolische functies van bacteriestammen met behulp van in de handel verkrijgbare kits (zie Materiaaltabel).</li>
</ol>8. Grieplabel, infectie en kolonisatie van bacteriën in GF-zebravisdarmen
OPMERKING: Voordat GF-zebravissen werden geïnfecteerd, werden de geïsoleerde bacteriën gemodificeerd met kleurstoffen en geteld, waardoor microbiële kolonisatie en migratie continu en in vivo zichtbaar werden (Figuur 6).
<ol><li>Kies potentiële nuttige bacteriën of dominante stammen met een hoge overvloed in de gastheer om de GF-vismodellen te infecteren. OPMERKING: De bacteriën die in deze studie werden gebruikt, waren Aeromonas sp. en Vibrio sp. (zie materiaaltabel), geselecteerd uit de 8 geslachten die in het laboratorium werden geïsoleerd en geïdentificeerd uit volwassen wildtype zebravissen42.</li>
	<li>Label de verse bacteriën met CM-Dil-kleurstoffen (zie materiaaltabel) en stel ze bloot aan GF-zebravissen bij 5 dpf met een concentratie van 106-10 8 Colony-Forming Units (CFU's)/ml.</li>
	<li>Observeer de fluorescentie onder de fluorescerende microscoop met een vergroting van 3× om de kolonisatie en verspreiding van bacteriën in de darm van GF-zebravislarven van 6 dpf en 14 dpf aan te geven.</li>
	<li>Tel handmatig het aantal bacteriën in GF-vis per plaatcultuur op elk tijdstip.</li>
	<li>Detecteer de kolonies en sequenties om er zeker van te zijn dat de infectie succesvol was met de beoogde bacteriestammen.</li>
	<li>Verzamel monsters van GF-vissen met een bacteriële infectie voor volgende tests, waaronder neurogedrag, ontwikkelingsindexen, histopathologische analyse en hormoonmetingen, enz. 43,44,45. OPMERKING: De bacteriën die in het infectie-experiment worden gebruikt, moeten pas worden hersteld en vers worden gekweekt door het vloeibare medium.</li>
</ol>

Optimalisatie van GF-zebravismodellen: generatie, onderhoud en microbiële studies

Het protocol van GF Artemia is als patent verleend door de China National Intellectual Property Administration, die het beperkte gebruik van de methode zal verlichten na het verkrijgen van de toestemming van de auteurs. De auteurs verklaren dat ze geen andere concurrerende of financiële belangen hebben.

Kritieke stappen binnen de protocollen van GF-vis en GF-voedselbereiding Tijdens het genereren van GF-vismodellen waren verschillende kritieke stappen betrokken, waaronder de voorbereiding van steriel materiaal, sterilisatie van embryo's, dagelijkse vernieuwing van GZM, het verzamelen van verschillende monsters en het steriele onderzoek van elk monster met behulp van meerdere methoden. Onder deze stappen is de eerste behandeling van embryo's fundamenteel en doorslaggevend voor het succes van GF-modellen. Controlemiddelen, hun concentraties en behandelingstijden zijn cruciaal voor het bereiken van optimale sterilisatiepercentages en het succes van het uitkomen. Zorgvuldige aandacht is nodig bij het hanteren van GF-visembryo's voor larven, waarbij dagelijks van medium wordt gewisseld en ervoor wordt gezorgd dat materialen en platforms grondig worden gesteriliseerd met behulp van ultraviolet licht of autoclaveren bij het verwijderen van platen uit de couveuse. Het bewaken van de temperatuuromstandigheden en de bedrijfstijd in de winter is essentieel om larvale sterfte te voorkomen die wordt veroorzaakt door lagere temperaturen in schone banken.
Steriel eigeel en GF Artemia moeten worden gedetecteerd voordat ze na 7 dpf aan vissen worden gevoerd om hun steriele toestand voor GF-modellen op lange termijn te garanderen. Tijdens de voederperiode is het reinigen van voedselresten belangrijk als onderdeel van de monsters die worden verzameld voor detectie bij het vernieuwen van het afvalmedium. De container, het volume van GZM en de voedselmassa moeten samen met de groei- en ontwikkelingsstadia worden aangepast om verlies van GF-vissen als gevolg van beperkte omgeving en problemen met de waterkwaliteit te voorkomen. Regelmatige monitoring en aanpassingen in deze parameters dragen bij aan het succesvol onderhouden van GF-vismodellen.
Wijzigingen en betekenis van deze protocollen Het vereenvoudigde proces in drie stappen voor het genereren van GF-zebravisembryo's, met geoptimaliseerde middelen, concentraties en blootstellingstijden van AB-GZM-, PVP-I- en NaClO-oplossingen, zorgt voor een hoge steriele snelheid en een gezonde ontwikkeling van modellen. Bovendien zijn de steriele detectiemethoden voor dagelijkse monsters geperfectioneerd om platen en vloeibare mediumculturen onder aërobe en anaërobe omstandigheden op te nemen, samen met moleculaire technieken met behulp van gewone bacteriële primers. Verdere ervaringen met het testen op bacteriële en schimmelcontaminanten zijn gericht op het optimaliseren van isolatorcontaminanten en steriele tests tijdens GF-diertechnieken48.
Het specifieke protocol voor GF Artemia nauplii als levend voer voor vismodellen is in onze studie onderzocht en er is een patent verleend aan PPJ en DSP door de China National Intellectual Property Administration (nr. ZL202210482684.8). GF-vismodellen op de lange termijn worden consequent beperkt door ontoereikende en ongeschikte voeding, waardoor zwakke punten in darmfuncties die verband houden met spijsvertering en absorptie worden verergerd. Als een geloofwaardige voedselbron voor medaka- en zebravismodellen in verschillende levensfasen, moet GF Artemia sp. gemakkelijk te bereiden zijn met een eenvoudige procedure, korte incubatietijd en real-time steriele detectie voor dagelijks gebruik. Bij deze methode worden normale Artemia-cysten gespoeld in een voldoende hoge concentratie NaClO om aseptisch te zijn en vervolgens geïncubeerd in een filmgecoate fles, evenals op een plaat en in een vloeibaar medium voor detectie. Dit ondersteunt vers uitkomende naupliën voor het voeren van GF-vissen. De steriele snelheid en het uitkomstpercentage van Artemia, evenals de lichaamslengte, het gewicht en de activiteit ervan, zijn uitstekend, wat wijst op beschikbare toepassingen in de praktijk.
Het belang van deze modificaties in GF-vis- en GF-voedselprotocollen komt onderzoekers ten goede bij het genereren van modellen bij embryo's, larven, juveniele stadia en zelfs vroege volwassen en volwassen stadia in mariene en zoetwatersoorten. GF-dieren op lange termijn zullen toestemming geven als in vivo modellen in onderzoek naar geneesmiddelscreening en microbiële functies tijdens de groei en ontwikkeling van de gastheer, vooral in de rijpheid van immuniteit en gerelateerde darmcellijnen. Zebravislarven bezitten bijvoorbeeld alleen aangeboren immuniteit in de eerste week en ontwikkelen vervolgens het adaptieve immuniteitssysteem gedurende 7-21 dpf, samen met de rijping van de thymus31,49. Bovendien kunnen GF-vismodellen de mogelijkheid bieden om interacties tussen bacteriën en bacteriën en microbiota-gastheer te analyseren met live observatie van dynamische kolonisatie- en migratieprocessen in organismen50,51.
Beperkingen van de methode Het kweken van GF-vissen van jonge vissen tot vroege volwassenen (28 dpf-2,5 mpf) en geslachtsrijpe volwassenen (>2,5 mpf) blijft een uitdaging vanwege de verhoogde sterfte en het risico op bacteriële besmetting tijdens het onderhoud van het model. Deze beperkingen komen voornamelijk voort uit het ontbreken van geschikte autocultuursystemen voor vissen die in een GF-omgeving leven. Deze systemen moeten schone lucht, water en een voedselsysteem omvatten om de dieren en hun omgeving effectief te onderhouden en volledige isolatie van externe micro-organismen te garanderen. In tegenstelling tot andere GF-diermodellen zoals muizen en kippen52, is het verkrijgen van GF-zebravissen door middel van anatomische operaties van de CR-ouders een uitdaging vanwege hun watergewoonten en natuurlijke bevruchtingsstijl.
Het is ook een uitdaging om volwassen dieren te behandelen als volledig verstoken van darmmicrobiota. Hoewel behandeling met antibiotica een toestand kan veroorzaken die vergelijkbaar is met die van specifieke pathogeenvrije (SPF) dieren, gekenmerkt door een verminderde microbiota gedetecteerd in fecale monsters, blijft het moeilijk om echte GF-volwassen vismodellen te bereiken. De uitdagingen die gepaard gaan met het opzetten en onderhouden van GF-modellen, vooral tijdens de overgang van jeugdige naar langdurige toestanden, zijn aanzienlijk. Het belang van GF-nakomelingen, zoals GF F1- of F2-eieren van volwassen GF-vissen, in microbieel onderzoek wordt erkend. Het overwinnen van uitdagingen bij het opzetten en onderhouden van volwassen GF-vismodellen op de lange termijn vereist echter veel tijd.
Het is vermeldenswaard dat gnotobiotische zebravissen met specifieke bacteriële kolonisatie zijn ontwikkeld, die chronische overleving laten zien op basis van GF-modellen. Toch blijft het onzeker of deze modellen kunnen dienen als levensvatbare alternatieven voor GF-modellen in bacteriële infectie en biomedisch onderzoek.
Toekomstige toepassingen van GF-vismodellen In deze studie hebben we het protocol verfijnd voor het genereren van GF-zebravismodellen, van embryo's tot juvenielen. Deze vooruitgang heeft belangrijke toepassingen in de ontwikkelingsbiologie, immunologie, onderzoek naar ziekten bij de mens en organogenese. Door middel van massa-isolatie en identificatie onderzoekt de studie de functies, mechanismen en van de darm afgeleide metabolieten van afzonderlijke bacteriestammen. Het onderzoek omvat het infecteren van GF-zebravismodellen nadat de ventilatieopening fase47,53 heeft geopend. Bovendien vergemakkelijken gelabelde bacteriën met fluorescentie de observatie van kolonisatie en distributie in levende GF-larven, vrij van andere microbiële invloeden54. Vergelijkbare GF-vismodellen, zoals zee- of zoetwatermedaka, kunnen worden gemaakt met behulp van vergelijkbare methoden met verschillende middelen of mediumveranderingen.
Om de mechanismen van menselijke ziekten te onderzoeken, maakt de studie gebruik van FMT-methoden, waarbij monsters van patiënten of donoren worden overgedragen aan gezonde dieren of GF-modellen55. In tegenstelling tot conventioneel gefokte (CR) dieren, bieden GF-modellen robuust bewijs van microbiële functies, effecten of reacties in de gastheer, vooral in combinatie met bacteriofagen om doelbacteriën in de microbiota te reguleren46.
Samenvattend dienen GF-zebravissen als krachtige modellen voor het beoordelen van bacteriële veiligheid, effectiviteit van geneesmiddelen, toxiciteit van verontreinigende stoffen of interferentie van verbindingen, vanwege hun gevoelige en zuivere darmomgeving. Toekomstige exploratie van GF-vistoepassingen moet verschillende gebieden omvatten, met de noodzaak om volwassen GF-vismodellen te creëren voor een beter begrip van microbiële functies in verschillende levensfasen.

De microbiota (d.w.z. Archaea, bacteriën, Eukarya en virussen) spelen een cruciale rol bij het handhaven van de gezondheid van de gastheer en dragen bij aan de ontwikkeling van verschillende ziekten door fysiologische en pathologische processen te beïnvloeden door middel van symbiotische interacties binnen de darmbarrière, het epitheeloppervlak en de mucinefuncties bij individuen 1,2,3. De samenstelling van de microbiota in verschillende levensfasen, van kindertijd tot jeugd, volwassenheid en veroudering, evenals de aanwezigheid ervan op verschillende locaties zoals neusgaten, mond-, huid- en darmlocaties, wordt dynamisch gevormd door diverse habitats en omgevingen4. De darmmicrobiota in organismen is betrokken bij de opname van voedingsstoffen, immuunrespons, invasie van ziekteverwekkers, metabole regulatie, enz. 5,6. Studies bij patiënten hebben aangetoond dat verstoringen in de darmmicrobiota verband houden met obesitas bij de mens, slaapstoornissen, depressie, inflammatoire darmaandoeningen (IBD), neurodegeneratieve ziekten (Parkinson, Alzheimer), veroudering en verschillende vormen van kanker 7,8,9. Bovendien omvatten interactieve routes tussen darmmicrobiota en gastheren ontstekingsfactoren, neurotransmitters, metabolieten, darmbarrière en oxidatieve stress, zoals waargenomen in eerder onderzoek met behulp van muizen- en vismodellen10,11.
Onlangs zijn meerdere bacteriegerelateerde benaderingen of therapieën, waaronder mogelijke probiotica en fecale microbiota-transplantatie (FMT), onderzocht voor deze aandoeningen in klinische en diermodellen. Deze verkenningen zijn gebaseerd op ontdekkingen met betrekking tot de microbiota-darm-hersenen/lever/nier-as, van microbiota afgeleide producten en veranderde receptoractiviteit 12,13. De ontwikkeling, verschillende functies en mechanismen van het microbiota-gastheersysteem worden echter nog steeds onvolledig begrepen en geïdentificeerd vanwege de complexiteit van de microbiële gemeenschap en de uitdaging om krachtige mensachtige ziektemodellen te genereren.
Om deze problemen aan te pakken, werden in het midden van de19e eeuw dringend kiemvrije (GF) diermodellen voorgesteld die voornamelijk in de 20eeeuw werden ontwikkeld. Latere verfijningen, waaronder met antibiotica behandelde en gnotobiotische modellen, samen met vooruitgang in microbiële detectie- en observatietechnologieën, perfectioneerden deze modellen verder 14,15,16. GF-dieren, gecreëerd door hun eigen achtergrond uit te wissen en omgevingsmicroben te vermijden, bieden een uitstekende strategie voor het verkennen van de interacties tussen micro-organismen en hun gastheren17. Door de toepassing van diermodellen en verfijnde protocollen hebben onderzoekers met succes vergelijkbare microbiële samenstellingen gerepliceerd die bij patiënten in GF-muizen en vissen worden aangetroffen. Bovendien bieden andere GF-diermodellen, zoals honden, kippen en varkens, diverse opties als proefpersonen 18,19,20,21. Deze aanpak heeft onderzoek mogelijk gemaakt naar de mogelijke therapeutische effecten van commensale microbiomen op verschillende ziekten, waaronder kankerimmunotherapie bij mensen16,18. GF-modellen bieden nauwkeuriger inzicht in de kenmerken en mechanismen van specifieke bacteriële kolonisatie, migratie, vermenigvuldiging en interactie binnen gastheren. Dit biedt cruciale nieuwe inzichten in het voorkomen en de ontwikkeling van microbiota-gerelateerde ziekten 22,23. De geschiedenis van het vaststellen en toepassen van GF-zebravissen in microbieel onderzoek is geëvolueerd van de rapporten van Rawls et al. in 2004 en Bates et al. in 2006 tot het protocol van Melancon et al. in 2017 16,24,25. De haalbaarheid van volwassen of fokkende GF-modellen is echter nog steeds een langdurig proces, dat gepaard gaat met een variabele levensduur, slagingspercentages en gezondheidsuitdagingen.
Van de verschillende diermodellen onderscheidt de zebravis (Danio rerio) zich als een cruciaal hulpmiddel voor zowel fundamenteel als biomedisch onderzoek vanwege de voordelige gelijkenis met menselijke organen en genomica, de korte ontwikkelingscyclus, de hoge vruchtbaarheid en transparante embryo's19,26. Zebravissen, die dienen als betrouwbare menselijke ziektemodellen, bieden een visuele weergave van fysiologische en pathologische processen in vivo en geven inzicht in de aantrekkelijke kenmerken van gastheer-microbe-interacties. Met name zebravissen vertonen verschillende cellijnen, waardoor beeldvorming van darmfysiologie, microbiële dynamiek, geslachtsklieren en reproductieve ontwikkeling, rijping van het immuunsysteem van de gastheer, gedrag en metabolisme mogelijkis. Zebravisembryo's ontwikkelen zich in beschermende chorionen tot ze uitkomen en worden 3 dagen na de bevruchting (dpf) larven. Ze jagen actief op voedsel bij 5 dpf en bereiken ongeveer 3 maanden na de bevruchting (mpf) geslachtsrijpheid28. De eerste succesvolle kiemvrije (GF) zebravis, gerapporteerd door Rawls et al.24, toonde aan dat larven die na dooierabsorptie met geautoclaveerd voer werden gevoed, weefselnecrose vertoonden vanaf 8 dpf en totale dood bij 20 dpf. Dit gaf de effecten van voeding aan of het belang van het overwegen van exogene nutriëntenvoorziening in experimenten met langdurige (>7 dpf) GF-vissen29. Latere studies verbeterden het generatieprotocol van GF-vissen, met behulp van steriel voedsel en methoden die in verschillende vismodellen warengeperfectioneerd16.
Het meeste onderzoek naar GF-zebravismodellen is echter gericht op vroege levensfasen, waarbij bacteriële infectie optreedt bij 5 dpf gedurende 24 uur tot 48 uur, met monsters verzameld vóór 7 dpf aan het einde van de experimenten 25,30,31. Het wordt algemeen erkend dat de microbiota in organismen, waaronder mensen en zebravissen, aan het begin van het leven wordt gekoloniseerd en gevormd tijdens groei en ontwikkeling. De samenstelling blijft stabiel in de volwassen stadia, waarbij de rol van de microbiota in de gastheer gedurende het hele leven cruciaal is, vooral bij veroudering, neurodegeneratieve, metabole obesitas en aspecten van darmziekten. Perspectieven van GF-dieren met een langere overleving kunnen dus inzicht geven in de mechanismen van microbiële rollen in de ontwikkeling en functies van gastheerorganen, rekening houdend met de onvolgroeide immuun- en voortplantingssystemen van vislarven in het vroege leven. Hoewel bacteriestammen in de darmen van zebravissen in eerdere studies zijn geïsoleerd en geïdentificeerd, wat het potentieel biedt voor het infecteren van GF-diermodellen om probiotica te selecteren of bacteriële functies in de gastheer te onderzoeken19,25, zijn het genereren en toepassen van GF-vismodellen voornamelijk beperkt tot vroege levensfasen. Deze beperking, toegeschreven aan het complexe productieproces, de hoge onderhoudskosten en de daarmee samenhangende problemen met voedsel en immuniteit, belemmert onderzoeksinspanningen die gericht zijn op het onderzoeken van de ontwikkelings- en chronische effecten van microbiota in de gastheer.
Het overlevingspercentage, het gedrag, de groei, de rijping en de algehele gezondheid van vissen, vooral in kiemvrije (GF) modellen, worden aanzienlijk beïnvloed door voedingspraktijken, waaronder de inname en absorptie van voeding tijdens de mondopen-periode van vroege larven tot juvenielen 32,33. Een van de uitdagingen bij de GF-visteelt is echter de schaarste aan geschikte steriele diëten, waardoor de effectiviteit van voedingsondersteuning voor het ondersteunen van de groei en overleving van larven wordt beperkt. Het oplossen van dit probleem is cruciaal voor het herstellen van het leven van GF-vissen, gezien hun ontwikkelingsafweermechanismen en zwakke spijsverteringsvermogen als gevolg van de afwezigheid van een darmmicrobioom. Levende artemia (Artemia sp.) komt qua voedsel naar voren als het meest geschikte dieet voor mondopen larven tot jonge vissen. Er is waargenomen dat vissen die worden gevoed met levende artemia hogere groei- en overlevingspercentages vertonen in vergelijking met vissen die worden gevoed met gekookt eigeel of ander natuurlijk en synthetisch aas34. Hoewel modellen voor het vroege leven van GF-vissen kunnen overleven met dooierondersteuning en GF-larvenmodellen kunnen worden onderhouden met steriele voeding, blijft het genereren van langetermijnmodellen van larven tot juvenielen en het bereiken van geslachtsrijpheid een uitdaging. Bovendien wordt vlokken- of poedervoer beperkt door een ongelijke voedingssamenstelling en kan het de waterkwaliteit beïnvloeden. Daarentegen heeft levende Artemia voordelen zoals overleving in zowel zout als zoet water, klein formaat geschikt voor larven tot volwassenen, gemak van batching en een hogere broedkwaliteit35. Voortbouwend op eerdere methoden 16,24,30, hebben we het complexe behandelingsproces vereenvoudigd en de dieetuitdaging aangepakt door gemakkelijk te incuberen GF levende Artemia sp. als steriel voedsel voor langere duur dan jonge GF-vissen.
Deze studie presenteert een geoptimaliseerd protocol dat (1) generatie, (2) onderhoud, (3) identificatie van steriele snelheid en (4) onderhoud en voeding omvat om de groei van kiemvrije (GF) zebravissen van embryo's tot larven en juveniele stadia te garanderen. De resultaten bieden voorlopig bewijs voor het uitkomen, de overleving, de groei en de steriliteit van GF-zebravissen, samen met essentiële indices voor GF Artemia sp. als steriel voedsel. De gedetailleerde stappen in het genereren en bereiden van steriel levend voedsel bieden cruciale technische ondersteuning voor het construeren en toepassen van GF-vismodellen op lange termijn, evenals GF Artemia sp. in onderzoek naar microbiota-gastheerinteractie. Het protocol richt zich op bacteriële isolatie, identificatie en infectie op GF-vismodellen, schetst methoden voor bacteriële fluorescentie-etikettering en observeert hun kolonisatie in visdarmen onder een microscoop. GF-vissen, gnotobiotische vissen met een bacteriële infectie of overgedragen menselijke microbiota-modellen zullen verschillende detecties ondergaan om hun functies en effecten op de immuniteit, spijsvertering, gedrag, transcriptomische regulatie en metabole aspecten van de gastheer op te helderen. Op de lange termijn kan dit protocol worden uitgebreid naar verschillende wildtype vissoorten, zoals mariene medaka, en mogelijk naar andere geselecteerde transgene zebravislijnen die gecorreleerd zijn met specifieke weefsels of ziekten.

<table><tbody><tr><td>AB-GZM</td><td>Amphotericin:Solarbio;&nbsp; kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio.</td><td>Amphotericin:CAS:1397-89-3; kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313.</td><td>49.6 mL GZM, 50 &micro;L amphotericin stock solution (250 &micro;g/mL), 25 &micro;L kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 &micro;L ampicillin stock solution (20 mg/mL).</td></tr><tr><td>1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes</td><td>biosharp</td><td>BS-15-M</td><td>Om monsters te verzamelen en agenten vast te houden</td></tr><tr><td>2.4 g/L NaClO</td><td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td><td>CAS: 7681-52-9</td><td>Verdund met 8% natriumhypochloriet waterige oplossing.</td></tr><tr><td>6-well plates, 24-, 48- well plates</td><td>LABSELECT&nbsp;</td><td>11112</td><td>Voor het kweken van vissen</td></tr><tr><td>Aeronomas</td><td>NCBI database</td><td>No.MK178499</td><td>2019-JPP-ESN</td></tr><tr><td>Anaerobe TSA-platen</td><td>tryptone:Oxoid ; soja pepton:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agarpoeder:BioFroxx.</td><td>tryptone:LP0042B; soja pepton:Cat#S9500; NaCl:BS112; agarpoeder:9002-18-0.</td><td>De TSA-platen werden bereid met 400 mL medium dat 6 g tryptone, 2 g soja pepton, 2 g NaCl en 6 g agarpoeder bevat onder het anaerobe systeem.</td></tr><tr><td>Anaerobe werkstation</td><td>GENE SCIENCE</td><td>E200G</td><td>Bacterie-isolatie, steriele testen</td></tr><tr><td>Analyse</td><td>GraphPad Prism 5</td><td>v6.07</td><td>Om de gegevens te analyseren</td></tr><tr><td>API 20 E kits</td><td>&nbsp;BioMerieux SA, Frankrijk</td><td>No.1005915090</td><td>Ref 20100 Kits om bacteriële metabolisme te detecteren</td></tr><tr><td>Artemia (Brine shrimp)</td><td>Shangjia Aquarium Co., Ltd.</td><td>Aquamaster merk</td><td>Artemia cysten en brine shrimp eieren&nbsp;</td></tr><tr><td>Auto cyclussysteem voor viscultuur</td><td>Ningbo Hairui Technology Co., Ltd</td><td>No Cat</td><td>Vis onderhoud</td></tr><tr><td>Autoclaaf</td><td>Zeal Way</td><td>G154DWS</td><td>De materialen voorbereiden</td></tr><tr><td>BHI Aerobic</td><td>Coolaber</td><td>Cat#PM0640</td><td>BHI medium werd bereid, waarbij 100 mL medium 3,7 g BHI poeder bevatte.</td></tr><tr><td>BHI Anaerobic</td><td>Coolaber</td><td>Cat#PM0640</td><td>BHI medium werd bereid en verdeeld in anaerobe buizen onder het anaerobe systeem.</td></tr><tr><td>Biochemische incubator</td><td>LongYue Co., Ltd</td><td>SPX</td><td>Voor vissen en platen</td></tr><tr><td>Bioveiligheidskast</td><td>Haier</td><td>HR40-IIA2</td><td>Steriele behandeling en testen</td></tr><tr><td>Bleekmiddel van 0,02 g/L NaClO</td><td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td><td>CAS: 7681-52-9</td><td>Werkoplossing met natriumhypochloriet (NaClO) concentratie: Verdund met 8% natriumhypochloriet waterige oplossing of 166,6 uL 6% natriumhypochloriet met 500 mL gedestilleerd water.</td></tr><tr><td>Bloedplaten</td><td>schapenbloed:Solarbio</td><td>Cat. NO. TX0030</td><td>Steriel-defibrinerend schapenbloed werd toegevoegd aan TSA om 5% bloedplaten te bereiden.</td></tr><tr><td>Celcultuurkolf</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>Om vissen te kweken</td></tr><tr><td>CM-Dil kleurstoffen</td><td>Molecular Probes</td><td>Cat#C7000&nbsp;&nbsp;</td><td>Om de bacteriën te labelen</td></tr><tr><td>Constant temperatuur schudkweekincubator</td><td>Peiving Co., Ltd</td><td>HZQ-X100</td><td>Bacteriecultuur</td></tr><tr><td>Database</td><td>NCBI</td><td>Bacteria and Archaea database</td><td>Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/</td></tr><tr><td>Disponibel Pasteur pijpje</td><td>biosharp</td><td>bs-xh-03l</td><td>Gebruikt om water te verversen en eieren over te brengen</td></tr><tr><td>Disponibel petrischaal</td><td>biosharp</td><td>BS-90-D</td><td>Om vissen te kweken</td></tr><tr><td>DNA kits</td><td>Solaribio</td><td>Cat#D1600</td><td>Bacterie genomisch DNA extractie kits&nbsp;</td></tr><tr><td>Elektrische pijp</td><td>SCILOGEX</td><td>Levo me</td><td>Water verversen</td></tr><tr><td>Exiguobacterium</td><td>NCBI database</td><td>No.MK178504</td><td>2019-JPP-ESN</td></tr><tr><td>GZM</td><td>Zeezout:LANDEBAO Co., Ltd.</td><td>No Cat</td><td>Bestaande uit 1 L water en 1,5 mL zeezoutoplossing (40 g/L), geautoclaveerd. Het gehalte aan zeezout in de GZM-oplossing was 60 mg/L.</td></tr><tr><td>Laboratorium puur watersysteem</td><td>Hitech Co., Ltd</td><td>Prima-S15</td><td>De agenten voorbereiden</td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td>Met fluorescent licht om vislarven te observeren</td></tr><tr><td>PCR kits</td><td>TIANGEN</td><td>Cat#ET101</td><td>Taq DNA Polymerase kit</td></tr><tr><td>Pijp</td><td>LABSELECT&nbsp;</td><td>sp-013-10</td><td>Water verversen</td></tr><tr><td>Povidonjodium (PVP-I)</td><td>Aladdin</td><td>Lot#H1217005</td><td>Waterige oplossing povidone jodium 0,4 g/L zuiver water.</td></tr><tr><td>Timing converter</td><td>PinYi Co., Ltd</td><td>AL-06</td><td>Om het licht te regelen</td></tr><tr><td>TSA-platen</td><td>tryptone:Oxoid ; soja pepton:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agarpoeder:BioFroxx.</td><td>tryptone:LP0042B; soja pepton:Cat#S9500; NaCl:BS112; agarpoeder:9002-18-0.</td><td>TSA-platen werden bereid met 400 mL medium dat 6 g tryptone, 2 g soja pepton, 2 g NaCl, 6 g agarpoeder bevat.</td></tr><tr><td>TSB Aerobic</td><td>tryptone:Oxoid ; soja pepton:Solarbio ;NaCl:Biosharp;</td><td>tryptone:LP0042B; soja pepton:Cat#S9500; NaCl

generatie, onderhoud en identificatie van kiemvrije zebravismodellen van larven tot juveniele stadia

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

Zebravissen dienen als waardevolle modellen voor onderzoek naar groei, immuniteit en darmmicrobiota vanwege hun genomische overeenkomsten met zoogdieren, transparante embryo's ontwikkeld in een relatief schone chorionomgeving en extreem snelle ontwikkeling van larven in vergelijking met knaagdiermodellen. Kiemvrije (GF) zebravissen (Danio rerio) zijn cruciaal voor het evalueren van de toxiciteit van verontreinigende stoffen en het opstellen van mensachtige ziektemodellen die verband houden met microbiële functies. In vergelijking met conventioneel gekweekte (CR) modellen (vissen in de gewone houderij), maken GF-zebravissen een nauwkeurigere manipulatie van de gastheermicrobiota mogelijk, wat helpt bij het bepalen van het oorzakelijk verband tussen micro-organismen en gastheren. Bijgevolg spelen ze een cruciale rol bij het bevorderen van ons begrip van deze relaties. GF-zebravismodellen worden echter meestal gegenereerd en onderzocht tijdens de vroege levensfasen (van embryo's tot larven) vanwege beperkingen in de immuunfunctie en de opname van voedingsstoffen. Deze studie optimaliseert het genereren, onderhouden en identificeren van vroege GF-zebravismodellen zonder voeding en met langdurige voeding met GF-voer (zoals Artemia sp., artemia). Gedurende het hele proces werden dagelijkse bemonstering en kweek uitgevoerd en geïdentificeerd door middel van meerdere detecties, waaronder platen en 16S rRNA-sequencing. De aseptische snelheid, overleving en ontwikkelingsindexen van GF-zebravissen werden geregistreerd om de kwaliteit en kwantiteit van de gegenereerde modellen te waarborgen. Belangrijk is dat deze studie details geeft over bacteriële isolatie- en infectietechnieken voor GF-vissen, waardoor de efficiënte creatie van GF-vismodellen van larven tot juveniele stadia mogelijk wordt met GF-voedselondersteuning. Door deze procedures toe te passen in biomedisch onderzoek, kunnen wetenschappers de relaties tussen bacteriële darmfuncties en de gezondheid van de gastheer beter begrijpen.

De GF-zebravismodellen kunnen efficiënt worden geproduceerd door gebruik te maken van de overvloedige eieren die worden voortgebracht door paren zebravissen, waarbij het protocol is geoptimaliseerd op basis van eerdere GF-vismodellen35. Een enkele plaat met 6 putjes kan ongeveer 30-48 embryo's/larven kweken, waardoor voldoende gegevens kunnen worden verzameld en statistische analyse kan worden uitgevoerd. Na steriele behandeling worden de GF-embryo's gekweekt in een schone incubator tot ze uitkomen tot larven na 48-72 uur, en wordt GZM dagelijks gewijzigd met de detectie van verzamelde monsters, wat cruciaal is voor het handhaven van de kiemvrije toestand (Figuur 1). Na 7 dpf moet het voer van eigeel en levende Artemia worden bereid voor larven tot juveniele stadia. Tijdens de groei en ontwikkeling van vissen moeten het volume, de container en de dichtheid van GZM op tijd worden gereguleerd of gewijzigd om dood en falen van de steriele status te voorkomen. Als de detectie geen bacteriële vervuiling aantoont, kunnen de succesvolle GF-modellen worden gehandhaafd als chronisch model van juveniel tot vroege volwassenheid, maar de overlevingskans is in de praktijk veel lager. Ten slotte kunnen de steriele snelheid, het overlevingspercentage, de ontwikkelingsindex, het gedrag, de histopathologische analyse en het transcriptieprofiel van GF- en CR-vismodellen worden gemeten om de invloed van microbiota en medicijnscreeningvelden te onderzoeken. In deze studie werden de belangrijkste ontwikkelingsindexen vergeleken (aanvullende figuur 1) en het uitkomstpercentage van GF-vissen was 45,7% lager dan dat van CR-vissen, met 60% bij 72 hpf. De hartslag van GF-larven bij 7 dpf was significant lager bij 18,2 slagen/10 s in vergelijking met CR-vissen met 22,6 slagen/10 s, maar er was geen verschil tussen de twee groepen bij 14 dpf met snelheden van 23,5-23,8 slagen/10 s. Het overlevingspercentage van GF-vissen bij 7 dpf was hetzelfde als voor CR-vissen (86,7%), maar daalde tot 60% bij 14 dpf, vergeleken met 80% voor CR-vissen. De overlevingspercentages van zowel GF- als CR-vissen daalden echter tot 25%-10% na de periode waarin de mond open ging, toen ze voedingsvaardigheden of -gewoonten verwierven. Het niet behouden van de steriele status van vissen was een van de redenen voor het lagere overlevingspercentage. Daarom zijn voeding en onderhoud van voedingsstoffen van juveniele tot vroege volwassenheid cruciale uitdagingen in de visteelt.
Een andere belangrijke factor die de groei en ontwikkeling van vissen beïnvloedt, is voeding. In deze studie onderzoeken we meerdere methoden om GF Artemia te verkrijgen als levend voer voor langdurige GF-zebravislarven voor jonge en volwassen dieren (proces weergegeven in figuur 2). Vanwege het dagelijkse gebruik van voer voor GF-vissen, zou het geoptimaliseerde protocol voor GF Artemia in de praktijk eenvoudig, tijdbesparend en economisch moeten zijn. Na vergelijking van de actieve beweging en dood/immobiliteit van nauplii waargenomen door de microscoop, kenmerken van nauplii, niet-uitgekomen eieren en schaal, wordt de methode geperfectioneerd. Na dagelijkse incubatie werden de indexen van verse GF Artemia verkregen uit flessen, inclusief het uitkomen, de overleving en het misvormingspercentage, en de lengte en het gewicht van nauplii, waargenomen en gemeten onder de microscoop (Figuur 3). Na de behandeling was het uitkomstpercentage van Artemia-cysten hoog, met een gemiddelde van 88,15%, de overleving van zwemmende nauplii was 77,83% en het misvormingspercentage was 1,87%. De lichaamslengte van nauplii was 546,70 μm en de lichaamsgewichtindex was 3,80 mg/100, die geschikt zijn voor het vangen en voeden van vissen vanaf de open periode van de larven tot juveniele en volwassen stadia.
De detectie van GF-vissen en GF-Artemia is ook belangrijk voor het onderhoud van modellen. Op basis van monsterverzameling en meerdere testmethoden kunnen de resultaten het succes opleveren van behandelde zebravisembryo's en Artemia-cysten in de gekweekte plaat en het vloeibare medium (Figuur 4). De verschillende monsters die dagelijks worden verzameld, moeten in alle testmethoden als steriel worden gedetecteerd, wat vervolgens de GF-modellen kan aangeven op het moment van verzamelen. De GF Artemia moet worden gedetecteerd voordat u zich voedt met GF-vissen, of de resultaten van de plaat- en mediumincubator moeten verwijzen naar de steriele toestand van verse levende nauplii. Dat wil zeggen, kweek GF Artemia uit cysten op TSA-platen of TSB- of BHI-vloeibaar mediumglas in schudincubatie, dat tegelijkertijd kan worden gebruikt voor het genereren van GF Artemia en steriele verificatie. Het GF Artemia-protocol kan een beperkt aantal larven bevatten voor voeding. Tijdens het voederproces was het duidelijk dat de GF Artemia in de GZM zwom en vervolgens werd gevangen en geconsumeerd door de GF-vislarven.
De toepassingen van GF-vismodellen hebben betrekking op verschillende gebieden in de biologie en de geneeskunde, waardoor onder andere onderzoek naar microbiële functies, groei en ontwikkeling, ziektemechanismen en probiotische of geneesmiddelscreening mogelijk is46. In deze studie werden bijvoorbeeld twee belangrijke darmbacteriën, Aeromonas sp. en Vibrio sp., geïsoleerd uit zebravissen. De kenmerken en identificatie van de kolonie werden uitgevoerd en meerdere metabolische functies werden in vitro gemeten met behulp van in de handel verkrijgbare kits (Figuur 5). Deze bacteriën werden geïsoleerd en geïdentificeerd met 16S-sequencing, en de resultaten van de ontploffing werden gepresenteerd in een eerder rapport42. De geïdentificeerde bacteriestammen maken wetenschappelijk onderzoek mogelijk naar de impact van enkele of gecombineerde microbiota op de gezondheid van de gastheer door de GF-vismodellen te infecteren. De transparantie van vislarven maakt de observatie mogelijk van fluorescentie-gelabelde bacteriële cellen met behulp van CM-Dil-kleurstoffen, waardoor kolonisatie en distributie in de darmen van GF-vissen wordt onthuld (weergegeven in figuur 6). Na bacteriële infectie bij 5 dpf kunnen GF-zebravislarven worden afgebeeld met een fluorescentiemicroscoop en continu worden waargenomen van 6 tot 14 dpf, wat inzicht geeft in microbiële functies in combinatie met ontwikkelingsindexen, histopathologische veranderingen en moleculaire veranderingen47.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig01.jpg"> Figuur 1: Protocol van GF zebravissen van embryo's tot larven en juvenielen. Belangrijke stappen in het genereren van GF-zebravissen zijn onder meer: (1) Verzameling van embryo's van wildtype zebravissen en plaatsing in AB-GZM. (2) Spoelbehandeling met PVP-I- en NaClO-middelen om volledige steriliteit te garanderen. (3) Kweek van GF-embryo's/larven in platen met 6 putjes met GZM, waarbij het medium dagelijks wordt vernieuwd. (4) Regulering van cultuurcondities voor optimale groei en ontwikkeling. (5) Bemonstering in verschillende ontwikkelingsstadia, gevolgd door steriliteitstesten met behulp van plaat- en vloeibare mediummethoden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig02.jpg"> Figuur 2: Protocol van GF Artemia-bereiding als levend voer voor GF-vissen. De belangrijkste stappen zijn: (1) Spoelbehandeling van Artemia-cysten voor volledige steriliteit. (2) Bereiding van GF-cysten in het medium. (3) Incubatie in een zoutoplossing gedurende 24 uur om het uitkomen te bevorderen. (4) Filtratie van mislukte broedeieren en lege eieren om actieve nauplii te verzamelen. (5) Het wassen van verzamelde nauplii om vuil te verwijderen, waardoor levend voedsel van hoge kwaliteit en vrij van verontreinigingen wordt gegarandeerd. (6) Steriliteitstesten van de GF Artemia voordat deze aan GF-vislarven wordt gevoerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig03.jpg"> Figuur 3: Indexen van GF Artemia-cysten en nauplii geïncubeerd gedurende 24 uur. (A) Onbehandelde Artemia-cysten met onzuiverheidsfilm (schaalbalk: 500 μm). (B) Behandelde Artemia-cysten met een licht bol oppervlak na waterabsorptie en een schoner uiterlijk (schaalbalk: 500 μm). (C) Microscopisch onderzoek van vers geïncubeerde levende GF Artemia nauplii (schaalbalk: 2000 μm) en (D) vergroting met een schaalbalk van 1000 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig04.jpg"> Figuur 4: Steriele detectie van GF-vissen in elke levensfase en GF-artemia. (A) Steriele tests van CR- en GF-vismonsters met behulp van TSB- en BHI-vloeistofmedium, TSA en bloedplaten onder aërobe en anaërobe omstandigheden. (B) Steriele tests van onbehandelde Artemia-cysten , GF Artemia-cysten en nauplii met behulp van TSB- en BHI-vloeibaar medium, TSA en bloedplaten onder aërobe en anaërobe omstandigheden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig05.jpg"> Figuur 5: Isolatie en identificatie van darmbacteriën in zebravissen. (A) Bacteriestammen, kenmerken van kolonies, 16S-sequentiekaarten (voorbeelden: Aeromonas sp. en Vibrio sp.). (B) Toetredingen tot het geslacht en de NCBI. (C) Metabolische functies van bacteriën geïsoleerd uit de darm van zebravissen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig06.jpg"> Figuur 6: Infectie en kolonisatie van darmbacteriestammen in GF-zebravissen. (A) Herstel van geïsoleerde en geïdentificeerde bacteriestammen voor infectie-experimenten. (B) Etikettering van bacteriën met fluorescerende kleurstoffen en infectie van GF-zebravislarven bij 5 dpf. Vergroting: 1x. (C) Waarneming van de verspreiding en kolonisatie van bacteriën (Vibrio sp.) in darmweefsels in vivo. Vergroting: 3x. (D) Telling van CFU's van bacteriën (Aeromonas sp. en Vibrio sp.) in elke vislarve door dagelijkse bemonstering. De gegevens geven de gemiddelde ± SEM weer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Inleidingen</td>
			<td>Sequenties (5'-3')</td>
			<td>Lengte van het product</td>
		</tr><tr><td>27F</td>
			<td>AGAGTTTGATCMTGGCTCAG</td>
			<td rowspan="2">1465 k.p.</td>
		</tr><tr><td>1492R</td>
			<td>ACGGYTACCTTGTTACGACTT</td>
		</tr><tr><td>63F</td>
			<td>CAGGCCTAACACATGCAAGTC</td>
			<td rowspan="2">1324 k.p.</td>
		</tr><tr><td>1387R</td>
			<td>GGGCGGWGTGTACAAGGC</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Primers gebruikt voor bacteriële detectie.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Onderdelen</td>
			<td>Eenheden</td>
			<td>Inhoud (μL)</td>
		</tr><tr><td>Taq DNA-polymerase</td>
			<td>2,5 E/μL</td>
			<td>0.1</td>
		</tr><tr><td>10× Buffer (Mg2+)</td>
			<td>---</td>
			<td>2.1</td>
		</tr><tr><td>dNTP-mengsel</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td>1.6</td>
		</tr><tr><td>Inleiding 27F</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Inleiding 1492R</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>DNA/RNA vrij H2O</td>
			<td>---</td>
			<td>13.2</td>
		</tr><tr><td>Sjabloon DNA</td>
			<td>---</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Totaal volume</td>
			<td>---</td>
			<td>20</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 2: Eindconcentratie en volume van de componenten per reactie.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Stap</td>
			<td>Temperatuur</td>
			<td>Tijd</td>
			<td>Cycli</td>
		</tr><tr><td>Initiële denaturatie</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>4 min</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td>Denaturatie</td>
			<td>94 °C</td>
			<td>1 minuut</td>
			<td rowspan="3">35</td>
		</tr><tr><td>Annealing</td>
			<td>55 °C</td>
			<td>1 minuut</td>
		</tr><tr><td>Extensie</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>1 minuut</td>
		</tr><tr><td>Laatste verlenging</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>10 minuten</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td>Houden</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>∞</td>
			<td>--</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 3: PCR-programma voor amplificatie van het 16S rRNA-gen.
Aanvullende figuur 1: De kritische ontwikkelingsindexen van GF- en CR-zebravismodellen. (A) De uitkomstsnelheid van CR- en GF-zebravissen bij 72 hpf, en (B) hartslagen/10 s van CR- en GF-vissen bij 7 dpf en 14 dpf. De overlevingspercentages (%) van CR- en GF-vissen daalden van 7 dagen en 14 dagen met 86%, 60%-80% tot 10%-25% bij 30 dpf. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Dit protocol schetst de belangrijkste stappen voor het verkrijgen van kiemvrije (GF) visembryo's en het onderhouden ervan vanaf de larven tot het juveniele stadium, inclusief bemonstering en het detecteren van hun steriele status. Het gebruik van GF-modellen met infectie is belangrijk voor het begrijpen van de rol van microben in de gezondheid van de gastheer.

Generatie, onderhoud en identificatie van kiemvrije zebravismodellen van larven tot juveniele stadia

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

De reikwijdte van dit onderzoek is het genereren van nieuwe, kiemvrije diermodellen, die nuttige en krachtige hulpmiddelen zullen zijn bij het onderzoeken van verschillende microbioomfuncties. In dit veld zijn de vroege kiemvrije vismodellen recentelijk gebruikt, maar de langetermijnmodellen zijn nog steeds beperkt vanwege verschillende kweekomstandigheden en de ontwikkelingsverdediging van het personeel. De huidige GF-vismodellen zijn normaal gesproken vroege levensmodellen.De technologieën, waaronder de steriele weegschaal, de methoden voor het detecteren van monsters en het verstrekken van steriel voedsel, zijn dus zeer belangrijke uitdagingen die moeten worden overwonnen. Het kiemvrije zebravismodel is cruciaal voor het bestuderen van de interactie tussen gastheer en microbiota en hun impact op de ontwikkeling en de immuniteit en ziekte. Dit model stelt onderzoekers in staat om de enkele darmbacteriën nauwkeurig te manipuleren en het effect ervan op de transparante zebravisembryo's te observeren.Het biedt waardevolle inzichten in de rol van darmmicroben die de ziekte erven. In de toekomst zal ons onderzoek vooral gericht zijn op het opzetten van een kiemvrij zebravismodel voor de gehele levenscyclus om de functie van het darmmicrobioom beter te begrijpen.

generation-maintenance-identification-germ-free-zebrafish-models-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Een stap-voor-stap handleiding voor gerichte chimerisch zebravis embryo's genereren door transplantatie op de blastula of gastrulastadium.

Het genereren van Chimère zebravis embryo&#39;s door transplantatie

Dit protocol beschrijft regelmatig onderhoud en zorg aan optimale omstandigheden voor zebravis veeteelt te behouden. De video illustreert het protocol dat voor systeem onderhoud, regelmatige huisvesting, voeding, fokkerij, en het verhogen van de zebravis larven.

Regelmatige verzorging en onderhoud van een zebravis (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) Laboratorium: Een inleiding

De zebravis embryo is een uitstekend model voor ontwikkelingsbiologie onderzoek. Tijdens de embryogenese, zebravissen ontwikkelen met een dooier massa, die driedimensionale uitdagingen voor monster observatie en analyse presenteert. Dit protocol beschrijft hoe twee-dimensionale platte mount voorbereidingen van ganse berg in situ (WISH) gekleurd zebravis embryo exemplaren maken.

Flat Mount Voorbereiding voor observatie en analyse van de zebravis embryo Exemplaren gekleurd door Whole Mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

De zebravis is een krachtig modelsysteem voor ontwikkelingsbiologie en onderzoek naar menselijke ziekten vanwege hun genetische overeenkomsten met hogere gewervelde dieren. Dit protocol beschrijft een methodologie om haploïde zebravis-embryo's te creëren die kunnen worden gebruikt voor forward screen-strategieën om recessieve mutaties in genen die essentieel zijn voor vroege embryogenese te identificeren.

Productie van Haploid zebravis embryo&#39;s door<em&gt; In Vitro</em&gt; Bemesting

Zebravis als betrouwbare genetische modelorganismen in biomedisch onderzoek, vooral met de komst van gen-bewerken technologieën zijn gebruikt. Wanneer larvale fenotypen verwachting, kan DNA-extractie en genotype identificatie worden uitdagende. Hier beschrijven we een efficiënte genotypering procedure voor zebrafish larven, door de staart knippen, zo spoedig 72 uur na bevruchting.

High-throughput DNA-extractie en de genotypering van 3dpf Zebrafish larven door Fin knippen

Skeletspierregeneratie wordt aangedreven door weefsel ingezeten spierstamcellen, die bij veel spierziekten zoals spierdystrofie worden aangetast, en dit resulteert in het onvermogen van spieren om te regenereren. Hier beschrijven we een protocol dat het mogelijk maakt om spierregeneratie te onderzoeken in zebravismodellen van spierziekte.

Het onderzoeken van Spierregeneratie in Zebrafish Modellen van Spierziekte

Hier presenteren we een methode om de zebravis embryonale hersenen in vivo tot larvale en juveniele stadia in beeld te brengen. Deze microinvasieve procedure, aangepast aan elektrofysiologische benaderingen, biedt toegang tot cellulaire en subcellulaire details van volwassen neuronen en kan worden gecombineerd met optogenetica en neurofarmacologische studies voor het karakteriseren van hersenfunctie en medicamenteuze interventie.

In vivo beeldvorming van volledig actief hersenweefsel in wakkere zebravislarven en juvenielen door schedel- en huidverwijdering

De zebravis is onlangs gebruikt als model om potentiële stralingsmodificatoren te valideren. Het huidige protocol beschrijft de gedetailleerde stappen om zebravisembryo's te gebruiken voor op straling gebaseerde screeningsexperimenten en enkele observationele benaderingen om het effect van verschillende behandelingen en bestraling te evalueren.

Zebravislarven als model om potentiële radiosensibilisatoren of beschermers te evalueren

We presenteren een protocol voor het vastleggen van de dynamica van regeneratie van de staartvin van zebravislarven op een volledige weefselschaal met behulp van stereomicroscopie op basis van helder veld. Deze techniek maakt het mogelijk om de regeneratiedynamica met een enkele celresolutie vast te leggen. Deze methodologie kan worden aangepast aan elke stereomicroscoop uitgerust met een CCD-camera en time-lapse software.

Vastleggen van Tissue Repair in zebravis Larven met Time-lapse Helderveld stereomicroscopie

In deze studie beschrijven we een eenvoudige methode om Evans Blue Dye (EBD) analyse uit te voeren op zebravislarven. Deze techniek is een krachtig hulpmiddel voor de karakterisering van de integriteit van skeletspieren en de afbakening van zebravismodellen van spierdystrofie, en is een waardevolle methode voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische behandelingen.

Analyse van de zebravis Larven skeletspieren Integriteit met Evans Blue Dye

Leer hoe je kiemvrije zebravisembryo's genereert en onderhoudt van larve tot juveniel stadium. Deze methode maakt onderzoek naar gastheer-microbioom interacties en ontwikkeling mogelijk.

Generatie, onderhoud en identificatie van kiemvrije zebravismodellen van larven tot juveniele stadia

Meer video's verkennen