Name: Verbeterde genoombewerking via oviductale nucleïnezuren Op levering gebaseerde in vivo elektroporatietechniek voor het genereren van knock-out muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Ontdek de I-GONAD-methode voor genoombewerking in muizen met behulp van in utero-elektroporatie en CRISPR/Cas9. Deze techniek vereenvoudigt het genereren van knock-out muizen en vermindert diergebruik aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Fujihara, Y., Ikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-Based+Genome+Editing+in+Mice+by+Single+Plasmid+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-Based Genome Editing in Mice by Single Plasmid Injection.</a> Methods Enzymol. 546, 319-336 (2014).</li>
<li>Zuo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+complete+gene+knockout+mice+and+monkeys+by+CRISPR%2FCas9-mediated+gene+editing+with+multiple+sgRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">One-step generation of complete gene knockout mice and monkeys by CRISPR/Cas9-mediated gene editing with multiple sgRNAs.</a> Cell Res. 27 (7), 933-945 (2017).</li>
<li>Hubrecht, R. C., Carter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3Rs+and+humane+experimental+technique%3A+Implementing+change%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change.</a> Animals. 9 (10), 754(2019).</li>
<li>Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+i-GONAD+suitable+for+production+of+genome-edited+C57BL%2F6+inbred+mouse+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Modification of i-GONAD suitable for production of genome-edited C57BL/6 inbred mouse strain.</a> Cells. 9 (4), 957(2020).</li>
<li>Takabayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+i-GONAD+in+mice+at+early+zygote+stage+through+in+vivo+electroporation+three+minutes+after+intra-oviductal+instillation+of+CRISPR-ribonucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Successful i-GONAD in mice at early zygote stage through in vivo electroporation three minutes after intra-oviductal instillation of CRISPR-ribonucleoprotein.</a> Int J Mol Sci. 23 (18), 10678(2022).</li>
<li>Sato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+i-GONAD%3A+An+improved+in+vivo+technique+for+CRISPR%2FCas9-based+genetic+manipulations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Sequential i-GONAD: An improved in vivo technique for CRISPR/Cas9-based genetic manipulations in mice.</a> Cells. 9 (3), 546(2020).</li>
<li>Kessler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiple+super-enhancer+region+establishes+inter-TAD+interactions+and+controls+Hoxa+function+in+cranial+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A multiple super-enhancer region establishes inter-TAD interactions and controls Hoxa function in cranial neural crest.</a> Nat Commun. 14 (1), 3242(2023).</li>
<li>Kaneko, T., Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+genome+editing+by+electroporation+using+embryos+artificially+removed+cumulus+cells+in+the+oviducts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Improvement of genome editing by electroporation using embryos artificially removed cumulus cells in the oviducts.</a> Biochem Biophys Res Commun. 527 (4), 1039-1042 (2020).</li>
<li>Gurumurthy, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+CRISPR-based+germline-genome-engineered+mice+without+ex+vivo+handling+of+zygotes+by+i-GONAD%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD.</a> Nat Protoc. 14 (8), 2452-2482 (2019).</li>
<li>Ohtsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((i-GONAD%3A+A+robust+method+for+in+situ+germline+genome+engineering+using+CRISPR+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">i-GONAD: A robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases.</a> Genome Biol. 19 (1), 25(2018).</li>
<li>Marshall, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PerlPrimer%3A+Cross-platform%2C+graphical+primer+design+for+standard%2C+bisulphite+and+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">PerlPrimer: Cross-platform, graphical primer design for standard, bisulphite and real-time PCR.</a> Bioinformatics. 20 (15), 2471-2472 (2004).</li>
<li>Truett, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+PCR-quality+mouse+genomic+DNA+with+hot+sodium+hydroxide+and+Tris+%28HotSHOT%29%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and Tris (HotSHOT).</a> BioTechniques. 29 (1), 52-54 (2000).</li>
<li>Brinkman, E. K., Van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantitative+evaluation+of+CRISPR+genome+editing+by+TIDE+and+TIDER%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+Gene+Editing%22%5BJournal%5D)">Rapid quantitative evaluation of CRISPR genome editing by TIDE and TIDER.</a> CRISPR Gene Editing. 1961, 29-44 (2019).</li>
<li>Imai, Y., Tanave, A., Matsuyama, M., Koide, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+editing+in+wild+strains+of+mice+using+the+i-GONAD+method%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient genome editing in wild strains of mice using the i-GONAD method.</a> Sci Rep. 12 (1), 13821(2022).</li>
<li>Iwata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+large-scale+chromosomal+engineering+of+mouse+zygotes+viain+vitro+and+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Simple and large-scale chromosomal engineering of mouse zygotes viain vitro and in vivo electroporation.</a> Sci Rep. 9 (1), 14713(2019).</li>
<li>Abe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+large-fragment+knock-in+animal+production+without+ex+vivo+handling+of+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A novel technique for large-fragment knock-in animal production without ex vivo handling of zygotes.</a> Sci Rep. 13 (1), 2245(2023).</li>
<li>Meyer-Dilhet, G., Courchet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+cortical+electroporation+of+plasmids+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">In utero cortical electroporation of plasmids in the mouse embryo.</a> STAR Protocols. 1 (1), 100027(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,5&ndash;5 µL pipette&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642020</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL tube</td><td>Aptaca</td><td>1003/G</td><td></td></tr><tr><td>100-1000 µL pipette&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642090</td><td></td></tr><tr><td>200 µL tube</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>20-200 µL pipette&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642080</td><td></td></tr><tr><td>2-20 µL pipette&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642060</td><td></td></tr><tr><td>4x Gel Loading Dye</td><td>Biolabmix</td><td>D-3002</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>AppliChem</td><td>A8963,0500</td><td></td></tr><tr><td>DNase I, RNase-free (1 U/&micro;L)</td><td>Thermo Fisher</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set, 100 mM Solution</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0181</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green DNA Polymerase (5 U/&micro;L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0713</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s modified phosphate-buffered saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EditCo ICE Analysis</td><td>https://ice.editco.bio/#/</td><td></td><td>accessed on 04.06.2025</td></tr><tr><td>EDTA 0,5M solution, pH = 8</td><td>AppliChem</td><td>A4892,0500</td><td></td></tr><tr><td>Ensembl</td><td>&nbsp;https://www.ensembl.org/index.html</td><td></td><td>accessed on 09.06.2025</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Biolabmix</td><td>EtBr-10</td><td></td></tr><tr><td>Eye gel drops &ldquo;Oftagel&rdquo;</td><td>URSAPHARM</td><td>204604</td><td></td></tr><tr><td>Gel-documenting system ChemiDoc XRS+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>In-Silico PCR V39x1&nbsp;</td><td>https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr</td><td></td><td>&nbsp;accessed on 09.06.2025</td></tr><tr><td>Integrated DNA Technologies&nbsp;</td><td>https://eu.idtdna.com</td><td></td><td>accessed on 09.06.2025</td></tr><tr><td>Microsurgical scissors</td><td>Medin URAL</td><td>M124</td><td></td></tr><tr><td>NEPA21 electroporator</td><td>Nepa Gene</td><td>NEPA21</td><td>With CUY652P2.5X4 electrode</td></tr><tr><td>NTP Set, 100 mM Solution</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotides</td><td>Evrogen</td><td></td><td>direct order, standard desalting purification</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>PerlPrimer</td><td>https://perlprimer.sourceforge.net</td><td></td><td>Version 1.1.21.</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/&micro;L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>F530L</td><td></td></tr><tr><td>pipette 10 µL tips</td><td>Ulplast</td><td>HT-10-960</td><td></td></tr><tr><td>pipette 1000 µL tips</td><td>Ulplast</td><td>HT-1000-576</td><td></td></tr><tr><td>pipette 200 µL tips</td><td>Ulplast</td><td>HT-200-960</td><td></td></tr><tr><td>Power supply &ldquo;Elf-4&rdquo;</td><td>DNA-technology</td><td>PS-400 NEW</td><td></td></tr><tr><td>RNAse/DNAse free water</td><td>Invitrogen</td><td>10977049</td><td></td></tr><tr><td>Saline solution</td><td>PanEco</td><td>P011n</td><td></td></tr><tr><td>SE-1 horizontal electrophoresis system</td><td>Helicon</td><td>SE-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td>Step100 DNA Ladder</td><td>Biolabmix</td><td>S-8100</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope SMZ1000</td><td>Nikon</td><td>5-363376</td><td></td></tr><tr><td>Stripper micropipetter</td><td>CooperSurgical</td><td>MXL3-STR</td><td></td></tr><tr><td>Stripper tips</td><td>ORIGIO</td><td>MXL3-125</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Needle&nbsp;</td><td>KMIZ</td><td>4A1- 0,6&times;20</td><td></td></tr><tr><td>Suturing forceps</td><td>Medin URAL</td><td>M302.2</td><td></td></tr><tr><td>Suturing forceps</td><td>Medin URAL</td><td>M303</td><td></td></tr><tr><td>Suturing thread POLYCON N<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68704/68704eq1.jpg" style="margin: auto;"/>0</td><td>Tonzos 95</td><td>234</td><td></td></tr><tr><td>SYNTHEGO Knockout Guide Design&nbsp;</td><td>https://design.synthego.com/#/</td><td></td><td>accessed on 09.06.2025</td></tr><tr><td>T100 amplifier</td><td>BioRad</td><td>10014822</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polymerase&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0111</td><td></td></tr><tr><td>TBE 10x buffer</td><td>Biolabmix</td><td>TBE-500</td><td></td></tr><tr><td>Tide&nbsp;</td><td>https://tide.nki.nl/</td><td></td><td>accessed on 04.06.2025&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris hydrochloride</td><td>Suzhou Yacoo Science</td><td>SYS-S0005-0.5</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2663</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>TrueCut Cas9 Protein</td><td>Invitrogen</td><td>A36499</td><td></td></tr><tr><td>Universal scissors</td><td>Medin URAL</td><td>M147</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Interchemie Werken de Adelaar</td><td>IX2</td><td></td></tr><tr><td>Zoletil</td><td>Virbac Lab</td><td>2000443714739.00</td><td></td></tr></tbody></table>

verbeterde genoombewerking via oviductale nucleïnezuren op levering gebaseerde in vivo elektroporatietechniek voor het genereren van knock-out muizen

Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery-based In Vivo Electroporation Technique for Knockout Mice Generation

Verbeterde genoombewerking via oviductale nucleïnezuren Op levering gebaseerde in vivo elektroporatietechniek voor het genereren van knock-out muizen

Methods for creating knockout mice typically involve three main steps: (1) collecting embryos from donor females, (2) microinjecting genetic constructs ...

improved-genome-editing-via-oviductal-nucleic-acids-delivery-based

Research

JoVE Journal

Genetics

Om de functie en de regulatie van genen tijdens de ontwikkeling van middenhersenen dopaminerge neuronen te beoordelen, beschrijven we een methode die inhoudt...

In ovo Elektroporatie in Chick middenhersenen voor het bestuderen van gen-functie in dopaminerge Neuron Ontwikkeling

Designer nucleasen zoals zinkvinger nucleasen (ZFNs) en transcriptie activator-achtige effector nucleasen (Talens) kan worden gebruikt om het genoom van de muis implantatie embryo's wijzigt activeren zowel de homologe eind mee (NHEJ) en homologe recombinatie (HR) wegen. Deze voorschotten in staat de snelle generatie van muizen met precieze genetische modificaties.

Mouse Genome engineering behulp Designer Nucleasen

De microinjectie van muis oocyten wordt vaak gebruikt voor zowel klassieke transgenese ( dwz de willekeurige integratie van transgenen) en CRISPR-gemedieerde gen targeting. Dit protocol beoordeelt de nieuwste ontwikkelingen in microinjectie, met speciale nadruk op kwaliteitscontrole en genotyping strategieën.

Generatie van genetisch gemodificeerde muizen via de microinjectie van oocyten

Hier presenteren we een aangepaste methode voor cryopreservatie van eencellige embryo's, evenals een protocol dat het gebruik van gevriesontdooide embryo's en elektroporatie koppelt voor de efficiënte generatie van genetisch gemodificeerde muizen.

Gebruik van gevriesde embryo's voor hoogrendementproductie van genetisch gemodificeerde muizen

Het huidige protocol beschrijft zygote micro-injectie van CRISPR-Cas9 en donor-DNA om efficiënt gencassette knock-in en floxed muizen te produceren.

Zygote micro-injectie voor het maken van gencassette knock-in en flox-allelen bij muizen

Hier beschrijven we een eenvoudige techniek die bedoeld is voor de efficiënte generatie van genetisch gemodificeerde muizen, CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Deze methode levert bewerkingsreagentia door elektroporatie in embryo's met een efficiëntie van bijna 100%. Dit protocol is effectief voor puntmutaties, kleine genomische inserties en deleties in zoogdierembryo's.

Efficiënte genoombewerking van muizen door CRISPR-elektroporatie van zygoten

Hier presenteren we een protocol voor het ontwikkelen van genetisch gemodificeerde muismodellen met behulp van embryonale stamcellen, vooral voor grote DNA knock-in (KI). Dit protocol is afgestemd met behulp van CRISPR / Cas9-genoombewerking, wat resulteert in een aanzienlijk verbeterde KI-efficiëntie in vergelijking met de conventionele homologe recombinatie-gemedieerde lineaire DNA-targetingmethode.

CRISPR/Cas9-gemedieerde zeer efficiënte gentargeting in embryonale stamcellen voor het ontwikkelen van gen-gemanipuleerde muismodellen

Dit protocol beschrijft micro-injectie en in vivo elektroporatie voor regionaal beperkte CRISPR-gemedieerde genoombewerking in de eileider van de muis.

Somatische genoom-engineered muismodellen met behulp van in vivo micro-injectie en elektroporatie

Dit protocol presenteert een geoptimaliseerde aanpak voor het produceren van genetisch gemodificeerde rattenmodellen. Adeno-geassocieerd virus (AAV) wordt gebruikt om een DNA-reparatiesjabloon af te leveren, en elektroporatie wordt gebruikt om CRISPR-Cas9-reagentia af te leveren om het genoombewerkingsproces in een 2-cellig embryo te voltooien.

CRISPR-Cas9 Genoombewerking van rattenembryo's met behulp van adeno-geassocieerd virus (AAV) en elektroporatie van 2-celembryo's

De afgifte van genoomredacteuren als RNA's is een bijzonder krachtig middel om de genomen van primaire zoogdiercellen en cellijnen te modificeren. Het doel van dit protocol is om genoomeditoren als mRNA te leveren in primaire zoogdiercellen en cellenlijnen, gevolgd door gerichte Illumina-sequencing en analyse om bewerkingsuitkomsten te kwantificeren.

Genoombewerking in primaire zoogdiercellen via elektroporatie van editor-RNA

Ontdek de I-GONAD-methode voor genoombewerking in muizen met behulp van in utero-elektroporatie en CRISPR/Cas9. Deze techniek vereenvoudigt het genereren van knock-out muizen en vermindert diergebruik aanzienlijk.

Verbeterde genoombewerking via oviductale nucleïnezuren Op levering gebaseerde in vivo elektroporatietechniek voor het genereren van knock-out muizen (Video) | JoVE Journal

Verbeterde genoombewerking via oviductale nucleïnezuren Op levering gebaseerde in vivo elektroporatietechniek voor het genereren van knock-out muizen

Meer video's verkennen