Chromatografia kolumnowa

1. Zawiesina z żelu krzemionkowego

1. Wlać żel krzemionkowy do kolby Erlenmeyera. Masa materiału opakowaniowego powinna być około 50 razy większa niż masa oddzielanej próbki. Jeśli rozdzielane związki mają bardzo podobne wartości R_f, może to wymagać użycia większej ilości krzemionki na próbkę, co ma miejsce w tym przykładzie.
   1. Umieścić 10 g krzemionki w kolbie Erlenmeyera, ponieważ izoluje się 50 mg próbki (45 mg fluorenonu i 5 mg tetrafenyloporfiryny).
2. Dodać roztwór rozpuszczalnikowy (heksan/dichlorometan, 70%: 30%) do kolby Erlenmeyera zawierającej żel krzemionkowy. Dodaj tyle rozpuszczalnika, aby upewnić się, że cały żel krzemionkowy jest dobrze rozwiązany. Krzemionka nie rozpuści się, ale mieszanina będzie wizualnie zauważalna po solwatacji. Po dodaniu rozpuszczalnika zakręcić kolbą Erlenmeyera, aby upewnić się, że cała krzemionka jest dobrze rozpuszczona.

2. Przygotowanie kolumny

1. Wybierz kolumnę o odpowiednim rozmiarze. Zazwyczaj kolumna powinna być wypełniona mniej więcej do połowy zawiesiną żelu krzemionkowego. Im większa próbka jest oczyszczana, tym większa wymagana jest kolumna.
2. Zatkaj spód kolumny kawałkiem waty szklanej. Za pomocą długiego pręta upewnij się, że wełna jest mocno osadzona w dolnej części kolumny tuż nad kurkiem.
3. Gdy wełna jest już mocno osadzona, nałóż cienką warstwę piasku na wełnę szklaną.
   Uwaga: Jeśli kolumna jest wyposażona w frytę szklaną nad kurkiem, ten krok należy pominąć.
4. Clamp kolumnę w pozycji pionowej do stojaka pierścieniowego.
5. Za pomocą lejka delikatnie wlej przygotowaną zawiesinę żelu krzemionkowego do kolumny. Może być konieczne dodanie dodatkowego rozpuszczalnika w celu przeniesienia zawiesiny z kolby Erlenmeyera do kolumny. Za pomocą pipety zmyj żel krzemionkowy, który przykleja się do boków kolumny.
   1. Gdy żel krzemionkowy osiada w kolumnie, delikatnie postukaj w boki kolumny, aby upewnić się, że żel krzemionkowy jest szczelnie upakowany i wyklucza wszelkie pęcherzyki powietrza.
6. Otworzyć zawór odcinający i pozwolić, aby rozpuszczalnik spłynął do czystej kolby Erlenmeyera, aż do momentu, gdy żel krzemionkowy spotka się z czołem rozpuszczalnika. Żel krzemionkowy nigdy nie powinien wyschnąć, dopóki procedura nie zostanie zakończona.
7. Umieść cienką warstwę piasku na wierzchu żelu krzemionkowego (Rysunek 1). Za pomocą pipety zmyj piasek, który mógł przykleić się do boków kolumny.
8. Spuść dodatkowy rozpuszczalnik, aż piasek wyschnie, ale nie do warstwy żelu krzemionkowego.

Rysunek 1. Właściwe ustawienie do eksperymentu z chromatografią kolumnową przed dodaniem próbki.

3. Dodawanie próbki do kolumny

1. Rozpuścić próbkę w możliwie najmniejszej ilości rozpuszczalnika (przy użyciu tego samego rozpuszczalnika, który został użyty do wytworzenia zawiesiny żelu krzemionkowego).
2. Za pomocą pipety delikatnie dodaj próbkę do górnej części kolumny.
3. Po nałożeniu próbki na górną część kolumny należy otworzyć zawór odcinający i pozwolić rozpuszczalnikowi spłynąć przez warstwę piasku, ale nie przez warstwę żelu krzemionkowego. Użyj bardzo małej ilości rozpuszczalnika, aby zmyć próbkę, która mogła przylgnąć do ścianek kolumny. Spuść również ten dodatkowy rozpuszczalnik przez warstwę piasku.

4. Płukanie próbki przez kolumnę

1. Za pomocą pipety bardzo delikatnie dodaj 4–5 ml rozpuszczalnika w taki sposób, aby nie naruszyć warstwy piasku.
2. Umieść lejek w górnej części kolumny i bardzo powoli i delikatnie napełnij pozostałą część kolumny rozpuszczalnikiem.
3. Otwórz zawór odcinający i pozwól, aby rozpuszczalnik spłynął przez kolumnę.
4. Rozpocznij zbieranie fazy ruchomej, gdy spływa ona z kolumny do probówek.
   1. Probówki należy umieszczać w stojaku na probówki w sposób sekwencyjny.
5. W razie potrzeby dodaj dodatkowy rozpuszczalnik do górnej części kolumny, aż wszystkie pożądane związki zostaną wyeluowane z kolumny.

5. Odzyskiwanie składników

1. Jeśli związki są kolorowe, można je zidentyfikować wizualnie. Jeśli jednak związki są bezbarwne, będą musiały zostać zidentyfikowane za pomocą światła widzialnego (UV) (jeśli związki zawierają koniugację) lub za pomocą odpowiedniego barwnika. Czystość związków można zweryfikować za pomocą chromatografii cienkowarstwowej.
2. Zidentyfikuj probówki, które zawierają pożądany związek (związki).
3. Połączyć wszystkie frakcje, które zawierają pożądany wyizolowany związek(-i), do wstępnie zważonej kolby okrągłodennej (RB). Zrób to dla każdego izolowanego związku.
4. Odparować rozpuszczalnik, umieszczając kolbę RB na wyparce obrotowej.
5. Po usunięciu całego rozpuszczalnika zważyć RB z wysuszonym produktem i odjąć początkową masę RB w celu uzyskania wydajności.