Name: Mikroiniekcja mRNA i oligonukleotydów antysensownych morfolino w zarodkach danio pręgowanego. (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-07T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Poznaj technikę mikroiniekcji mRNA i oligonukleotydów morfolino w zarodkach Danio rerio. Ta metoda umożliwia nadekspresję genów i knockdown w badaniach biologii rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez NIH oraz fundację PKD dla ZS. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Yale Animal Resources Center (YARC) oraz Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

Część 1: Przygotowanie mikropipet oraz płytek komory do mikroiniekcji
<ol>
	<li>Wykonaj mikropipety poprzez podgrzewanie i wyciąganie kapilarnych rurek ze szkła borokrzemianowego (World Precision Instruments, Inc., 1B100-4) w urządzeniu do wyciągania mikropipet (Sutter Instruments Inc., Flaming/Brown P-97). Przechowuj je w szalce Petri na niewielkiej ilości gliny lub taśmy klejącej.</li>
	<li>Wlej 1,5% agarozę (American Bioanlytical, Inc., AB00972-00500) w 1x medium E3 do płytek z uformowanymi klinowatymi wgłębieniami, które posłużą jako łatwy sposób unieruchomienia embrionów podczas iniekcji (opisane w 'The Zebrafish Book") 1. Pozostaw płytki z komorami agarowymi do stężenia przed użyciem i przechowuj w temperaturze 4ºC.</li>
</ol>
Część 2: Przygotowanie RNA
Jedną z potężnych metod badania funkcji genów jest mikroiniekcja transkrybowanego in vitro RNA z czapką do zarodków ryb danio pręgowanych. RNA z czapką zachowuje się podobnie do eukariotycznych mRNA występujących in vivo dzięki obecności analogu CAP. Badacze ryb danio pręgowanych rutynowo wykorzystują tę metodę w celu nadekspresji lub błędnej ekspresji badanego genu. W niniejszej demonstracji przeprowadzimy mikroiniekcję transkryptu znakowanego EGFP i wykorzystamy ekspresję GFP w żywych całych zarodkach jako widoczny wskaźnik pomyślnej iniekcji.
<ol>
	<li>Przeprowadź reakcję transkrypcji RNA z czapeczką (CAP RNA) in vitro dla wybranego transkryptu. W naszym laboratorium rutynowo wstawiamy cDNA interesujący nas gen w wektor pCS2+ i przeprowadzamy reakcję syntezy in vitro dużych ilości RNA z czapeczką, wykorzystując zestaw mMessage mMachine SP6 (Ambion, Inc., AM1340).</li>
	<li>Oczyść próbkę RNA, przepuszczając ją przez zestaw RNeasy Mini (Qiagen, Inc., 74104) lub stosując ekstrakcję fenol:chloroform oraz precypitację izopropanolem.</li>
	<li>Dokładnie określ stężenie preparatu RNA i przechowuj w temperaturze -80ºC do momentu użycia.</li>
	<li>W dniu iniekcji rozmroź próbkę RNA, lekko wymieszaj w wirówce typu vortex i krótko odwirowuj.</li>
	<li>Przygotuj roztwór roboczy w sterylnej wodzie z końcowym stężeniem 0,025 - 0,050% czerwieni fenolowej (Sigma-Aldrich Co., P0290). Czerwień fenolowa służy jako marker wizualny potwierdzający wstrzyknięcie roztworu do zarodka. W niniejszym artykule przygotujemy roztwór roboczy mRNA EGFP o stężeniu 100 ng/uL z 0,050% czerwieni fenolowej.</li>
	<li>Próbkę roboczą przechowuj w lodzie, a zapas RNA przenieś z powrotem do -80°C.</li>
	<li>Przejdź do Części 4, gdy będziesz gotowy do iniekcji tej próbki.</li>
</ol>
Część 3: Przygotowanie morfolino
Antysensowne oligonukleotydy morfolinowe są szeroko stosowane do modyfikacji ekspresji genów poprzez blokowanie translacji docelowego białka lub modyfikację splicingu pre-mRNA 2,3. Morfoliny u danio pręgowanego stanowią potężne narzędzie genetyki odwrotnej, umożliwiając wyciszenie funkcji genu. W niniejszym artykule przeprowadzimy mikroiniekcję oligonukleotydu morfolinowego skierowanego na miejsce inicjacji translacji genu pkd2 (5′-AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC-3′). W oparciu o wcześniej opublikowane prace oczekujemy, że zaaplikowane embriony będą fenotypowo przypominać ryby mutanty pkd24.
<ol>
	<li>Zwyczajowo zamawiamy 300 nmol oligonukleotydu morpholino, zaprojektowanego specyficznie dla genu zainteresowania, z firmy Gene Tools, LLC (Philomath, OR).</li>
	<li>Dodaj 100 uL sterylnej wody, aby przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 3 mM. Rozdziel roztwór na alikwoty i przechowuj w temperaturze -20°C do momentu użycia.</li>
	<li>W dniu iniekcji podgrzewaj roztwór morpholino w temperaturze 65°C przez 5 minut. Natychmiast schłodź w lodzie i krótko wiruj. Krok ten denaturuje ewentualne struktury drugorzędowe oligonukleotydu i zapewnia całkowite rozpuszczenie roztworu.</li>
	<li>Przygotuj roztwór roboczy, rozcieńczając roztwór morpholino w sterylnej wodzie do końcowego stężenia 0,025 - 0,050% czerwieni fenolowej. W niniejszej demonstracji przygotujemy roztwór roboczy morpholino pkd2 o stężeniu 0,50 mM z 0,050% czerwieni fenolowej.</li>
	<li>Przechowuj roztwór roboczy w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przejdź do Części 4, gdy będziesz gotowy do iniekcji tej próbki.----</li>
</ol>
Część 4: Napełnianie mikropipety roztworem roboczym
<ol>
	<li>Odciąć dystalną końcówkę mikropipety za pomocą pęsety lub chirurgicznej żyletki, aby stworzyć otwór widoczny pod mikroskopem stereoskopowym (Nikon Instruments, Inc., SM2645) przy powiększeniu 50X.</li>
	<li>Nanieść 2 uL roztworu roboczego w postaci kropli na szkiełko nakrywkowe.</li>
	<li>Przymocować tylną część mikropipety do strzykawki 5 mL wyposażonej w dren na igle hipodermicznej i lekko zanurzyć dystalną końcówkę mikropipety w kropli roztworu roboczego. Należy uważać, aby nie złamać końcówki mikropipety.</li>
	<li>Zassać roztwór roboczy przez dystalny koniec mikropipety, cofając tłok strzykawki.</li>
</ol>
Część 5: Kalibracja objętości iniekcji mikropipety
<ol>
	<li>Nanieś kroplę oleju mineralnego (American Bioanalytical, Inc., AB00921-00025) na szkiełko mikrometryczne (Fisher, 12-561-SM1).</li>
	<li>Włącz zasilanie oraz dopływ powietrza do aparatu mikrowstrzykiwacza impulsowego (World Precision Instruments Inc., PV830).</li>
	<li>Zamocuj mikropipetę w uchwycie mikropipet mikrowstrzykiwacza. Mikrowstrzykiwacz jest regulowany ciśnieniowo, a wstrzykiwanie jest aktywowane poprzez naciśnięcie pedału nożnego.</li>
	<li>Pod mikroskopem sekcyjnym sprawdź objętość wstrzykiwania, używając mikrowstrzykiwacza do naniesienia kropli roztworu roboczego na olej mikrometryczny. Zmierz średnicę kropli, która unosi się w formie sfery na powierzchni oleju.</li>
	<li>Dostosuj czas trwania i ciśnienie wstrzykiwania, aby precyzyjnie skalibrować objętość iniekcji. Krok ten wspomaga powtarzalność eksperymentu z mikrowstrzykiwania. W niniejszej demonstracji wszystkie mikrowstrzyknięcia będą wykonywane z średnicą kropli wynoszącą 0,15 mm (objętość około 1,76 nL).</li>
	<li>Po skalibrowaniu objętości wstrzykiwania użyj pokrętła „Hold” w mikrowstrzykiwaczu, aby zapobiec cofaniu się cieczy i wyciekom z mikropipety.</li>
</ol>
Część 6: Przygotowanie zapłodnionych zarodków danio pręgowanego do mikroiniekcji
<ol>
	<li>Zebry będą się losowo rozmnażać w ciągu pierwszych kilku godzin każdego ranka. Należy zebrać embriony w stadium 1 komórki i umieścić je w medium E3 1x.</li>
	<li>Za pomocą pipety transferowej 3 mL (Becton Dickinson Labware, 357524) należy ułożyć embriony wzdłuż klinowatych rynien w płytkach do komory mikroiniekcyjnej.</li>
	<li>Należy usunąć medium w taki sposób, aby embriony były płytko zanurzone, a nie zalane. Krok ten ułatwia osiadanie embrionów na dnie rynien, a także penetrację chorionu przez mikropipetę.</li>
</ol>
Część 7: Mikroiniekcja przez chorion
<ol>
	<li>Manipuluj zarodkami za pomocą mikropipety tak, aby cytoplazma zarodka w stadium 1-komórkowym była widoczna pod mikroskopem stereoskopowym. Uważaj, aby nie złamać końcówki mikropipety.</li>
	<li>Przebij mikropipetą chorion, a następnie żółtko, aby wykonać iniekcję do zarodka. W tej demonstracji najpierw wykonamy mikroiniekcję do żółtka bezpośrednio pod komórką, pozwalając, aby przepływ cytoplazmy i dyfuzja wprowadziły roztwór roboczy do wnętrza komórki. Przepływ ten jest widoczny dzięki dodatkowi czerwieni fenolowej do roztworu roboczego.</li>
	<li>Zademonstrujemy również bezpośrednią iniekcję do cytoplazmy komórki. Bezpośrednia mikroiniekcja do komórki jest bardziej skuteczna, ale czasochłonna, ponieważ wymaga prawidłowej orientacji zarodka i odpowiedniej techniki mikroiniekcji. Ponieważ błona komórkowa jest bardziej odporna niż błona żółtka, często szybciej jest wprowadzić mikropipetę przez żółtko, aby dotrzeć do cytoplazmy komórki. Pomocne w tej metodzie iniekcji może być skierowanie bieguna zwierzęcego w stronę dna korytka oraz pewność ruchów dłoni.</li>
	<li>Po mikroiniekcji umieść zarodki w szalce Petriego z medium E3 i inkubuj je w temperaturze 28.5°C w celu zapewnienia prawidłowego rozwoju.</li>
	<li>W ciągu kolejnych kilku godzin i dni rozwoju zarodkowego obserwuj zarodki pod kątem interesujących Cię fenotypów.</li>
</ol>
Część 8: Reprezentatywne wyniki
Nadekspresja mRNA EGFP: Aby zweryfikować powodzenie mikroiniekcji, będziemy monitorować ekspresję GFP w rozwijających się embrionach począwszy od stadium tarczy (~6 hpf) za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii całego embrionu in vivo (Leica Microsystems GmBh, MZFLIII). Ekspresja konstruktu jest najsilniejsza podczas wczesnych etapów rozwoju embrionalnego i często słabnie w trakcie rozwoju, w miarę stopniowej degradacji wstrzykniętego RNA z czapeczką, co zależy od stabilności ekspresowanego białka.
pkd2 translational-blocking morpholino: W oparciu o wcześniej opublikowane wyniki oczekujemy, że morfanty pkd2 będą naśladować zakrzywienie grzbietowej osi ciała występujące u mutantów pkd2 u danio pręgowanego i wykażą obecność cyst nerkowych mniej więcej w 2 - 3 dpf4.
<img alt="Porównanie fluorescencji zarodków danio pręgowanego; normalne vs mutacja pkd2; badanie z zakresu biologii rozwoju." src="/files/ftp_upload/old/1113/1113fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Reprezentatywne wyniki mikroiniekcji mRNA EGFP oraz morfolino AUG pkd2. (a) Zarodki TAB poddano mikroiniekcji w stadium 1 komórki z 0.17 ng mRNA EGFP i wizualizowano w 1 dpf w celu oceny ekspresji GFP in vivo. (b,c) Zarodki TAB poddano mikroiniekcji w stadium 1 komórki z ~1.7 nl morfolino blokującego translację pkd2 o stężeniu 0.50 mM i oceniono pod kątem zakrzywienia ciała w części grzbietowej w 4 dpf.

<ol><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.++A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th, University of Oregon. (2000).</li>
<li>Nasevicius, A., Ekker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat Genet. 26, 216-220 (2000).</li>
<li>Draper, B., Morcos, P., Kimmel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+zebrafish+fgf8+pre-mRNA+splicing+with+morpholino+oligos%3A+a+quantifiable+method+for+gene+knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown.</a> Genesis. 30, 154-156 (2001).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+cilia+genes+as+a+principal+cause+of+cystic+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A genetic screen in zebrafish identifies cilia genes as a principal cause of cystic kidney.</a> Development. 131, 4085-4093 (2004).</li>
<li>Stuart, G., McMurray, J., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication%2C+integration+and+stable+germ-line+transmission+of+foreign+sequences+injected+into+early+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos.</a> Development. 103, 403-412 (1988).</li>
<li>Stuart, G., Vielkind, J., McMurray, J., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+lines+of+transgenic+zebrafish+exhibit+reproducible+patterns+of+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression.</a> Development. 109, 577-584 (1990).</li>
<li>Culp, P., Nüsslein-Volhard, C., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+germ-line+transmission+of+plasmid+DNA+sequences+injected+into+fertilized+zebrafish+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7953-7957 (1991).</li>
<li>Strehlow, D., Heinrich, G., Gilbert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The fates of the blastomeres of the 16-cell zebrafish embryo.</a> Development. 120, 1791-1798 (1994).</li>
<li>Helde, K., Wilson, E., Cretekos, C., Grunwald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+early+cells+to+the+fate+map+of+the+zebrafish+gastrula%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Contribution of early cells to the fate map of the zebrafish gastrula.</a> Science. 265, 517-520 (1994).</li>
<li>Lin, S., Long, W., Chen, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+germ-line+chimeras+in+zebrafish+by+cell+transplants+from+genetically+pigmented+to+albino+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Production of germ-line chimeras in zebrafish by cell transplants from genetically pigmented to albino embryos.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 4519-4523 (1992).</li>
<li>Long, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA-1+expression+pattern+can+be+recapitulated+in+living+transgenic+zebrafish+using+GFP+reporter+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">GATA-1 expression pattern can be recapitulated in living transgenic zebrafish using GFP reporter gene.</a> Development. 124, 4105-4111 (1997).</li>
<li>Murphey, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+screening+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Small molecule screening in the zebrafish.</a> Methods. 39, 255-261 (2006).</li>
</ol>

Mikroiniekcja do zarodków danio pręgowanego jest uznaną i niezawodną techniką służącą do badania roli konkretnego genu w rozwoju. Zastosowania obejmują testy nadekspresji, błędnej ekspresji oraz wyciszania badanego genu, a także analizę epistatyczną między wieloma genami. Mikroiniekcja u danio pręgowanego jest szeroko stosowana do tworzenia zwierząt transgenicznych oraz mapowania losów komórek we wczesnych embrionach w stadium blastuli5,6,7,8,9. Ponadto zastosowanie tej techniki stanowi kluczowy etap w generow...

<table><tbody><tr><td>1x pożywka E3</td><td>Odczynniki</td><td></td><td></td><td>5 mM NaCl&lt;br/&gt;0,17 mM KCl&lt;br/&gt;0,33 mM CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt;0,33 mM MgSO4&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt;0,1% błękitu metylenowego</td></tr><tr><td colspan="5">Wszystkie pozostałe materiały zostały wymienione w protokole.</td></tr></tbody></table>

mikroiniekcja mrna i morfolinoowych oligonukleotydów antysensownych w embriony ryb danio pręgowanych.

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Niezbędnym narzędziem do badania roli genu podczas rozwoju jest możliwość przeprowadzania badań nad wyciszaniem (knockdown), nadekspresją oraz błędną ekspresją genów. U danio pręgowanego (Danio rerio), mikroiniekcja RNA, DNA, białek, oligonukleotydów antysensownych i innych małych cząsteczek do rozwijającego się zarodka zapewnia badaczom szybki i niezawodny test do analizy funkcji genówin vivoW niniejszym artykule wideo zademonstrujemy, jak przygotować i mikroiniekowaćin vitrosyntetyzowany mRNA EGFP oraz blokujący translację oligonukleotyd morfolinowy przeciwkopkd2, genu związanego z autosomalną dominującą wielotorbielowatością nerek (ADPKD), do embrionów rybek danio w stadium 1 komórki. Następnie przeanalizujemy skuteczność mikroiniekcji mRNA i morfolino poprzez weryfikację ekspresji GFP oraz analizę fenotypu. Szerokie zastosowania tej techniki obejmują tworzenie zwierząt transgenicznych i chimer linii zarodkowej, mapowanie losów komórek oraz screening genowy. W niniejszym dokumencie opisujemy protokół nadekspresji EGFP oraz knockdownupkd2poprzez wstrzyknięcie mRNA i oligonukleotydów morfolinowych.

Mikroiniekcja jest uznaną i skuteczną metodą wprowadzania obcych substancji do zapłodnionych embrionów danio pręgowanego. W niniejszej pracy prezentujemy niezawodną technikę mikroiniekcji służącą do przeprowadzania badań nad nadekspresją mRNA oraz wyciszaniem genów za pomocą morfolino oligonukleotydów u danio pręgowanego.

Mikroiniekcja mRNA i morfolinoowych oligonukleotydów antysensownych w embriony ryb danio pręgowanych.

Niezbędnym narzędziem do badania roli genu podczas rozwoju jest możliwość przeprowadzenia wyciszenia (knockdown), nadekspresji oraz ekspresji ektopowej genu ...

Procedura rozpoczyna się od przygotowania morpholino oraz mRNA z kapią otrzymanym w drodze transkrypcji in vitro. Mikropipetę napełnia się poprzez zasysanie roztworu zawierającego morpholino, a następnie kalibruje objętość iniekcji, korzystając z podstawki mikrometrycznej z pojedynczą komórką. Następnie zbiera się embriony danio pręgowanego i układa je w komorze do mikroiniekcji w celu wykonania mikroiniekcji w żółtko.Roztwór roboczy wstrzykuje się do żółtka tuż poniżej komórki, a następnie wykorzystuje się ruchy cytoplazmatyczne do przetransportowania roztworu w celu mikroiniekcji do komórki. Po wykonaniu iniekcji wstrzyknąć roztwór do cytoplazmy komórki. Inkubować embriony w temperaturze 28,5 °C w medium E3 i oceniać występowanie interesujących fenotypów na kolejnych etapach rozwoju.Witam, nazywam się Shiloh Yuen i reprezentuję laboratorium dr Sashy oraz Katedrę Genetyki w Yale University School of Medicine. Dzisiaj zaprezentujemy skuteczną technikę mikroiniekcji służącą do przeprowadzania badań nad nadekspresją mRNA oraz wyciszaniem genów za pomocą morfolino oligonukleotydów u rybek danio pręgowanych. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania roli rzęsek w torbielowatych chorobach nerek.Zacznijmy zatem. Jednym z potężnych podejść w badaniach nad funkcją genów jest mikroiniekcja transkrybowanego in vitro RNA z czapką do embrionów ryb danio pręgowanych. W tej demonstracji przeprowadzimy mikroiniekcję transkryptu z tagiem EGFP i wykorzystamy ekspresję GFP w żywym, całym embrionie jako widoczny wskaźnik udanej iniekcji.W pierwszej kolejności przeprowadzimy reakcję transkrypcji RNA z czapką in vitro dla badanego transkryptu. W naszym laboratorium rutynowo wstawiamy interesujący nas cDNA do wektora pCS2+, a następnie przeprowadzamy reakcję syntezy in vitro dużych ilości RNA z czapką, korzystając z zestawu mMessage mMachine SP6. Następnie oczyścimy próbkę RNA, przepuszczając ją przez zestaw RNeasy Mini lub stosując ekstrakcję fenolowo-chloroformową i precypitację izopropanolem.Dokładnie określ stężenie preparatu RNA i przechowuj go w temperaturze -80 °C do momentu użycia w dniu iniekcji. Odmroź próbkę RNA, lekko wymieszaj w wortexie i krótko odwiruj. Następnie przygotuj roztwór roboczy w wodzie sterylnej o stężeniu końcowym czerwieni fenolowej od 0,025 do 0,05%; czerwień fenolowa służy jako widoczny marker iniekcji roztworu do zarodka.W tym etapie przygotujemy roztwór roboczy mRNA EGFP o stężeniu 100 ng/µL z dodatkiem 0,05% czerwieni fenolowej. Na koniec należy przechowywać próbkę roboczą w lodzie, a zapas RNA przenieść do temperatury -80°C. Gdy nadejdzie czas wstrzyknięcia próbki, należy przystąpić do przygotowania morpho.Antysensowne oligonukleotydy morphino są powszechnie stosowane do modyfikacji ekspresji genów poprzez blokowanie translacji docelowego białka lub modyfikację splicingu pre-mRNA. Morphino w danio pręgowanym służą jako potężne narzędzie genetyki odwrotnej do wyciszania funkcji genów. W niniejszym materiale przeprowadzimy mikroiniekcję morphino skierowanego przeciwko miejscu inicjacji translacji genu pkd2. Rutynowo stosujemy 300 M morphino, zaprojektowanego specjalnie dla badanego genu, pozyskanego z firmy Gene Tools LLC.Następnie dodajemy 100 µL sterylnej wody, aby przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 3 mM, po czym rozdzielamy go na alikwoty i przechowujemy w temperaturze -20 °C do momentu użycia w dniu iniekcji. Roztwór morino podgrzewamy w temperaturze 65 °C przez pięć minut. Następnie roztwór gwałtownie schładzamy na lodzie i krótko wirujemy; ten etap denaturuje wszelkie struktury drugorzędowe w oligosach i zapewnia całkowite rozpuszczenie substancji.W następnym kroku przygotujemy roztwór roboczy poprzez rozcieńczenie roztworu Morpho w wodzie sterylnej do końcowego stężenia 0,025 do 0,05% czerwieni fenolowej. W tej demonstracji przygotujemy roztwór roboczy 0,5 mM PKD2 morino z 0,05% czerwieni fenolowej. Roztwór roboczy należy przechowywać w temperaturze pokojowej, a następnie przystąpić do napełniania mikropipety, gdy próbka będzie gotowa do wstrzyknięcia.Na początek należy wykonać mikropipety, które zostaną wykorzystane do iniekcji. Odbywa się to poprzez podgrzewanie i wyciąganie szklanych kapilar krzemianowych BOS w urządzeniu do wyciągania mikropipet. Po wyciągnięciu igieł są one przechowywane w szalce Petriego na niewielkiej ilości gliny lub taśmy klejącej.Następnie przygotujemy płytki z komorami do mikroiniekcji, wlewając 1,5% agarozy do trzech płytek z medium XE, posiadających formowane wgłębienia w kształcie klina. Posłuży to jako prosta metoda unieruchomienia embrionów podczas iniekcji. Płytki z komorami agarozowymi pozostawia się do stężenia, a następnie przechowuje w temperaturze 4 °C do momentu użycia.Aby rozpocząć napełnianie mikropipety, odetnij jej dystalną końcówkę za pomocą pęsety lub chirurgicznego ostrza, tworząc otwór ledwo widoczny pod mikroskopem stereoskopowym przy powiększeniu 50 x. Następnie nanieś dwa mikrolitry roztworu roboczego.Kładząc kroplę na szkiełku nakrywkowe, przymocuj tylną część mikropipety do strzykawki o pojemności 5 ml wyposażonej w rurkę zakończoną igłą hipodermiczną, a następnie lekko zanurz końcówkę dystalną mikropipety w kropli roztworu roboczego. Należy uważać, aby nie złamać końcówki mikropipety. Odessać roztwór roboczy przez koniec dystalny mikropipety, pociągając tłok strzykawki.W następnym kroku skalibrujemy objętość iniekcji mikropipety. Nanieś kroplę oleju mineralnego na szkiełko mikrometryczne, a następnie włącz zasilanie oraz dopływ powietrza do aparatu mikroinjektora impulsowego. Następnie zamocuj mikropipetę w uchwycie mikropipety w aparacie mikroinjektora.Mikroinżektor jest regulowany ciśnieniowo, a dozowanie jest aktywowane poprzez naciśnięcie pedału nożnego pod mikroskopem sekcyjnym. Sprawdź objętość wstrzykiwania, używając mikroinżektora do naniesienia kropli roztworu roboczego na olej mikrometryczny. Zmierz średnicę kropli, która unosi się w formie sfery na powierzchni oleju.Dostosuj czas trwania i ciśnienie wtrysku, aby precyzyjnie skalibrować objętość iniekcji. Krok ten sprzyja powtarzalności eksperymentu z mikrowtryskami. W niniejszej prezentacji wszystkie mikrowtryski zostaną wykonane przy średnicy kropli wynoszącej 0.15 millimeters.Na koniec, po skalibrowaniu objętości iniekcji, należy użyć pokrętła blokującego w mikroinjektorze, aby zapobiec cofaniu się cieczy oraz wyciekom z mikropipety. Teraz nadszedł czas na przygotowanie embrionów zebrafish. Ryby zebrafish kopulują w sposób losowy; w ciągu pierwszych kilku godzin każdego ranka, rozpoczynając przygotowania, należy zebrać embriony w stadium jednej komórki i umieścić je w pożywce XE 3.Za pomocą pipety transferowej o pojemności 3 ml rozmieść zarodki wzdłuż klinowatych rynien w płytkach komory do mikroiniekcji. Usuń nadmiar medium w taki sposób, aby zarodki były lekko zanurzone, a nie całkowicie zalane. Krok ten ułatwia osiadanie zarodków na dnie rynien oraz penetrację chorionu przez mikropipetę.Przejdziemy teraz do iniekcji. Najpierw za pomocą mikropipety ustawimy zarodki tak, aby cytoplazma zarodka w stadium jednej komórki była widoczna pod mikroskopem stereoskopowym. Należy uważać, aby nie złamać końcówki mikropipety; należy przebić chorion, a następnie żółtko, aby wprowadzić iniekcję do zarodka.W niniejszym pokazie najpierw wykonamy mikroiniekcję do żółtka bezpośrednio poniżej komórki, umożliwiając dopływ roztworu roboczego do wnętrza komórki poprzez cytoplazmat i dyfuzję. Przepływ ten jest widoczny dzięki dodatkowi czerwieni fenolowej do roztworu roboczego. Ponieważ jest to embrion jednokomórkowy, iniekcję można przeprowadzić ręcznie lub za pomocą manipulatora.Przeprowadzimy również demonstrację bezpośredniego wstrzyknięcia do cytoplazmy komórki. Bezpośrednia mikroiniekcja do komórki jest bardziej niezawodna, lecz czasochłonna, ponieważ wymaga odpowiedniej orientacji zarodka oraz precyzyjnej techniki mikroiniekcji. Ponieważ błona komórkowa jest bardziej odporna niż błona żółtka, często szybciej jest wprowadzić mikropipetę przez żółtko, aby dotrzeć do komórki.Orientacja cytoplazmy tak, aby biegun zwierzęcy był skierowany ku dołowi rynienki, oraz pewność rąk mogą pomóc w tej metodzie iniekcji. Po mikroiniekcji umieść embriony w szalce Petriego z pożywką E3 i inkubuj je w temperaturze 28,5 °C w celu zapewnienia prawidłowego rozwoju. Przez następne kilka godzin i dni rozwoju embrionów obserwuj je pod kątem interesujących Cię fenotypów.Aby zweryfikować powodzenie mikroiniekcji, będziemy monitorować ekspresję GFP w rozwijających się embrionach, zaczynając od stadium tarczy, za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii całego embrionu in vivo. Ekspresja konstruktu jest najsilniejsza podczas wczesnych etapów rozwoju embrionalnego i często słabnie w miarę rozwoju, ponieważ wstrzyknięty RNA z czapką jest stopniowo degradowany, a efekt zależy od stabilności ekspresowanego białka. W oparciu o wcześniej opublikowane wyniki spodziewamy się, że morfologiczna budowa PKD2 będzie naśladować wygięcie grzbietowej osi ciała, jakie występuje u zmutowanych danio pręgowanych PKD2, oraz że torbiele nerkowe pojawią się około dwóch do trzech dni po zapłodnieniu.Przedstawiliśmy właśnie niezawodną technikę mikroiniekcji służącą do przeprowadzania badań nad nadekspresją mRNA oraz wyciszaniem genów za pomocą oligonukleotydów morpholino u rybek danio-pręgowanych; pamiętajcie, że podczas wykonywania tej procedury kluczowe jest zachowanie pewnej i stabilnej ręki podczas iniekcji. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

microinjection-mrna-morpholino-antisense-oligonucleotides-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

W niniejszym filmie pokazano, w jaki sposób morpholino lub mRNA można wstrzyknąć do embrionów zebrafish w stadium jednej komórki, aby obniżyć lub zwiększyć poziom produktów konkretnych genów podczas dalszego rozwoju.

Mikroiniekcja embrionów ryb danio w celu analizy funkcji genów

Opracowano metodę bezpośredniego dostarczania morfolino do otocysty ryby zebrafish w 24hpf. Dzięki zastosowaniu mikroiniekcji morfolino do światła pęcherzyka słuchowego oraz elektroporacji w celu umożliwienia penetracji, udało się ominąć wpływ morfolino na mózg i uzyskać efekty specyficzne dla ucha wewnętrznego.

Bezpośrednie dostarczenie morfolin MIF do otocysty rybki danio poprzez wstrzyknięcie i elektroporację wpływa na rozwój ucha wewnętrznego

Opisano metodę warunkowego wyciszania ekspresji białka docelowego w siatkówce dorosłego danio-zebry, która polega na dokonywaniu iniekcji domięśniowych morfolino antysensownych oraz ich elektroporacji do siatkówki. W wyniku tego procesu ekspresja białka jest wyciszona przez kilka dni, co umożliwia zbadanie roli tego białka w regenerującej się lub nienaruszonej siatkówce.

In vivo elektroporacja morfolin do siatkówki dorosłego danio pręgowanego

Protokół opisuje celowe obniżenie ekspresji genów u danio pręgowanego poprzez wstrzyknięcie morfoliny w ogon.

Wstrzyknięcie morfolino: metoda obniżania docelowej ekspresji genów w celu zbadania funkcji u danio pręgowanego

Ten film opisuje technikę mikroiniekcji zarodka w celu dostarczenia związków do woreczka z żółtkiem danio pręgowanego.

Mikroiniekcja zarodka: technika dostarczania związku do żółtka danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy systematyczne podejście do opracowywania fizjologicznie istotnych, czułych i specyficznych testów in vivo do interpretacji zmienności w ludzkiej patologii. Przejściowa manipulacja genetyczna poprzez mikrowstrzyknięcie WT i zmutowanych ludzkich oligonukleotydów antysensownych mRNA i morfoliny (MO) wykorzystuje podatność rozwijającego się zarodka danio pręgowanego do szybkiego oznaczania mutacji patogennych, zwłaszcza, ale nie wyłącznie, w kontekście zaburzeń rozwojowych...

In vivo (in vivo) Modelowanie chorobliwego genomu ludzkiego przy użyciu Danio rerio

W tym artykule demonstrujemy metodę manipulowania ekspresją genów w komórkach komorowych dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego za pomocą antysensownych oligonukleotydów morfolino. Przedstawiamy tę metodę jako skuteczny i szybki protokół, który można wykorzystać do badań funkcjonalnych w mózgu dorosłego kręgowca.

Mikromanipulacja ekspresją genów w mózgu dorosłego danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji oligonukleotydów morfolino do komory mózgowej

Adaptowalna metoda odwrotnej genetyki dla danio pręgowanego do oceny funkcji genów podczas późniejszych etapów rozwoju i fizjologicznej homeostazy, takich jak regeneracja tkanek za pomocą dokomorowych iniekcji specyficznych dla genu morpholinos.

Odwrotne podejście genetyczne morpholino za pomocą wstrzyknięcia do komory serca w celu transfekcji wielu trudnych do namierzenia tkanek u larwy danio pręgowanego

W tym filmie Nijole Jasinskiene prezentuje metodologię wykorzystywaną do tworzenia transgenicznych komarów Aedes aegypti, które są wektorami gorączki Denga. Przedstawione zostają techniki prawidłowego przygotowania igieł do mikroiniekcji, wysuszania embrionów oraz przeprowadzania mikroiniekcji.

Mikroiniekcja zarodków A. aegypti w celu uzyskania transgenicznych komarów

W niniejszej pracy opisujemy metodę montowania embrionów zebrafish do długotrwałego obrazowania, obrazowania dwufotonowego, technik uszkadzania tkanek oraz konfokalnego obrazowania time-lapse.

Dwufotonowa aksotomia i konfokalne obrazowanie time-lapse w żywych embrionach danio pręgowanego

Poznaj technikę mikroiniekcji mRNA i oligonukleotydów morfolino w zarodkach Danio rerio. Ta metoda umożliwia nadekspresję genów i knockdown w badaniach biologii rozwoju.

Mikroiniekcja mRNA i morfolinoowych oligonukleotydów antysensownych w embriony ryb danio pręgowanych.

Przeglądaj więcej filmów