Negatywna selekcja immunomagnetyczna: metoda oczyszczania limfocytów B z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej

Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej lub PBMC obejmują limfocyty B, limfocyty T, komórki NK lub komórki NK oraz monocyty. Limfocyty B wytwarzają cząsteczki immunoglobuliny w celu zwalczania infekcji. W białaczce komórki te namnażają się i dają przerzuty do różnych narządów.

Aby wyizolować limfocyty B, zacznij od zawiesiny wyizolowanych PBMC. Dodaj pierwotną mieszaninę przeciwciał skierowaną przeciwko określonym cząsteczkom na powierzchni komórki, zwaną klastrem różnicowania lub CD. Specyficzne przeciwciała wiążą się z cząsteczką CD-3 na limfocytach T, cząsteczką CD-14 na monocytach i cząsteczką CD-16 na komórkach NK, pozostawiając limfocyty B nieznakowane.

Następnie umyj próbkę, aby usunąć niezwiązane przeciwciała. Dodaj do próbki wtórne mikrokulki magnetyczne sprzężone z przeciwciałami. Przeciwciała drugorzędowe wiążą się z regionem FC przeciwciał pierwszorzędowych przyłączonych do określonych komórek. Umieść probówkę zawierającą oznakowaną zawiesinę komórek pod wpływem pola magnetycznego. W polu magnetycznie znakowane komórki migrują i wiążą się ze ścianą rurki, co prowadzi do negatywnej selekcji niechcianych komórek. Zebrać supernatant zawierający wzbogacone limfocyty B do świeżej probówki zbiorczej.

W tym protokole przeprowadzimy negatywną selekcję immunomagnetyczną białaczkowych limfocytów B z PBMC pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową.

Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić 10 milionów PBMC w jednym mililitrze buforu izolacyjnego, który jest PBS z 0,1% BSA i 2 milimolowym EDTA, przy pH dostosowanym do 7,4. Limfocyty PBL muszą teraz zostać oczyszczone z preparatów PBMC. Następnie dodaj 10 mikrogramów mysich przeciwciał monoklonalnych anty-CD-3, CD-14 i CD-16 i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Po umyciu komórek buforem izolacyjnym i odwirowaniu w temperaturze 500 razy g przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, ponownie zawiesić 10 milionów PBMC w 1 mililitrze buforu izolacyjnego. Inkubować zawieszone komórki ze 100 mikrolitrami przemytych kulek magnetycznych przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza z delikatnym ponownym zawieszaniem. Następnie umieść probówkę w uchwycie magnetycznym na dwie minuty i przenieś supernatant z niezwiązanymi komórkami do świeżej probówki za pomocą pipety o pojemności 5 mililitrów. Po tym etapie oczyszczone limfocyty CLL są gotowe do użycia.