Przeszczepianie progenitorów neuronalnych pochodzących z komórek macierzystych do ludzkich wycinków korowych

Zacznij od przylegającej hodowli neuronalnych komórek progenitorowych pochodzących z komórek macierzystych, przygotowanych do różnicowania się w neurony korowe.

Usuń pożywkę, a następnie dodaj enzym, aby rozbić macierz zewnątrzkomórkową i odłączyć komórki.

Użyj inhibitora, aby zneutralizować enzym, a następnie dodaj świeżą pożywkę.

Przenieść zawiesinę do probówki, odwirować i wyrzucić supernatant w celu wyizolowania komórek.

Ponownie zawieś komórki w macierzy błony podstawnej, aby ułatwić przeszczep do tkanki mózgowej, a następnie załaduj je do zimnej rurki kapilarnej.

Weź ludzki plasterek kory mózgowej na zespół transwell zawierający pożywkę.

Usunąć część pożywki, a następnie wstrzyknąć kropelki zawiesiny komórkowej do tkanki.

Inkubować, aby matryca mogła się zestalić.

Dodaj pożywkę, aby zanurzyć tkankę, a następnie inkubować, aby umożliwić komórkom progenitorowym różnicowanie się w neurony, rozszerzanie ich neurytów i tworzenie synaps z neuronami korowymi gospodarza.

Wycinek kory mózgowej jest teraz gotowy do analizy.

Usunąć pożywkę z kolby do hodowli komórkowych. W siódmym dniu różnicowania odłącz komórki GFP-lt-NES zagruntowane korowo, dodając 500 mikrolitrów trypsyny i inkubuj przez 5 do 10 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie dodaj równą objętość inhibitora trypsyny, a następnie pięć mililitrów pożywki DDM. Ponownie zawiesić komórki, delikatnie przenieść zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki i wirować przez pięć minut w temperaturze 300 G. W międzyczasie przenieś płytkę zawierającą tkankę ludzką z inkubatora do kaptura i usuń dwa mililitry pożywki z górnej części wkładu. Pod koniec wirowania usunąć supernatant, ponownie zawiesić komórki w zimnej, czystej macierzy błony podstawnej i przenieść zawiesinę do mniejszej probówki.

Zbierz zawiesinę komórek do zimnej szklanej kapilary połączonej z gumowym smoczkiem w celu odsysania. Wstrzyknąć zawiesinę komórkową w postaci maleńkich kropli, wbijając półsuchy plasterek tkanki w różne miejsca. Pozostaw żel do zastygnięcia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Następnie przenieś płytkę z inkubatora z powrotem do kaptura i ostrożnie dodaj dwa mililitry pożywki korowej dla dorosłego człowieka do górnej części wkładki, aby całkowicie zanurzyć tkankę.