JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuroscience
0 wyświetleń • 4:18 min. • August 29th, 2025
Przymocuj znieczulonego szczura z urazem rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym na ramie stereotaktycznej.
Miejsce zmiany składa się z uszkodzonych aksonów i wypełnionych płynem jam otoczonych naciekającymi komórkami odpornościowymi, komórkami glejowymi i fibroblastami, które utrudniają odrost aksonów i regenerację funkcjonalną.
Zdezynfekuj i nacinaj skórę powyżej kręgosłupa. Wypreparuj mięśnie, aby odsłonić oponę twardą, zewnętrzną powłokę rdzenia kręgowego.
Wytnij tkankę bliznowatą z opony twardej, aby odsłonić miejsce uszkodzenia rdzenia kręgowego.
Umieść mikrostrzykawkę nad zmianą chorobową, zawierającą peptydy samoorganizujące się (SAP), i
wstrzyknij je do rdzenia zmiany po jednej stronie linii środkowej.
Powtórzyć wstrzyknięcie po przeciwnej stronie, aby uzyskać równomierne rozprowadzenie.
Następnie wstrzyknij neuronalne komórki prekursorowe (NPC) w miejsca otaczające zmianę, unikając rdzenia zmiany stanu zapalnego, aby zwiększyć przeżycie NPC.
Po wstrzyknięciu SAP samoorganizują się w rusztowanie, które naśladuje macierz zewnątrzkomórkową i łączy ubytki. Rusztowanie wspomaga przeżycie NPC i różnicowanie się w komórki nerwowe w celu przebudowy tkanek.
Iniekcję wykonuje się 14 dni po urazie rdzenia kręgowego. Przed rozpoczęciem operacji należy przygotować SAP w stężeniu 1% wagowo-objętościowym w sterylnej wodzie i napełnić roztworem szklaną kapilarnę o grubości 100 mikrometrów przymocowaną do strzykawki Hamiltona.
Przymocuj strzykawkę Hamiltona do ramy stereotaktycznej. Po znieczuleniu szczura należy umieścić głowę w ramce stereotaktycznej i zdezynfekować miejsce operacji jodonem powidonu i 70% alkoholem jak poprzednio. Jeszcze raz, po otwarciu skóry, ostrożnie wypreparuj parę mięśni kręgowych i włóż retraktory.
Użyj skalpela numer 15, aby usunąć tkankę bliznowatą z opony twardej i ponownie odsłonić miejsce zmiany. Następnie użyj końcówki ostrej igły, aby ostrożnie otworzyć oponę twardą. Na koniec, stereotaktycznie, wprowadź szklaną kapilarnę na głębokość dwóch milimetrów do uszkodzonego rdzenia kręgowego i wstrzyknij SAP.
Po wstrzyknięciu SAPs należy pozostawić naczynia włosowate w miejscu wstrzyknięcia przez jedną minutę przed usunięciem, aby umożliwić rozciągnięcie tkanki w celu dostosowania się do wstrzykniętego roztworu. Następnie powtórzyć wstrzyknięcie w następnym miejscu. W tym przypadku NPC zostały wyizolowane ze strefy przykomorowej dorosłej myszy czerwonej DS i hodowane zgodnie z wcześniej opublikowanymi procedurami.
Tuż przed mikrowstrzyknięciem rozcieńczyć NPC w pożywce wzrostowej do stężenia 50 razy 10 do trzeciej żywej komórki na mikrolitr do przeszczepu komórek i załadować do szklanej kapilary na strzykawce Hamiltona. NPC są wstrzykiwane natychmiast po wstrzyknięciu SAP-ów. W tym celu należy umieścić szklaną kapilarnę strzykawki Hamiltona w odległości 0,2 milimetra od miejsca urazu i 1,5 milimetra poniżej grzbietowej powierzchni rdzenia kręgowego.
Wstrzyknąć dwa mikrolitry zawiesiny komórkowej w tempie około 0,5 mikrolitra na minutę. Po zakończeniu pierwszego wstrzyknięcia należy pozostawić naczynia włosowate w rdzeniu kręgowym przez jedną minutę, tak jak poprzednio. Następnie należy cofnąć kapilarę, przesunąć ją w sąsiednie miejsce i powtórzyć procedurę iniekcji. Po odczekaniu minuty, tak jak poprzednio, cofnij kapilę i przesuń ją o dwa milimetry do miejsca urazu.
Wykonaj dwa wstrzyknięcia po dwa mikrolitry w tym miejscu.