JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Microbiology
0 wyświetleń • 2:28 min. • September 26th, 2025
Zacznij od hodowli E. coli wyizolowanej od noworodków z infekcjami krwi.
Odwirować w celu osadzenia bakterii, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w pożywce wolnej od antybiotyków.
Weź płytkę z wkładką transwell zawierającą monowarstwę komórek nabłonka jelitowego.
Zmierz opór elektryczny na całej warstwie ogniwa za pomocą sondy, aby potwierdzić integralność monowarstwy.
Dodać zawiesinę bakteryjną do wkładu i inkubować.
Bakterie przylegają do komórek nabłonka, są internalizowane w pęcherzykach i są transportowane przez komórki do dolnej studzienki w procesie zwanym transcytozą.
Ponownie zmierz opór elektryczny; Stabilna wartość potwierdza nienaruszoną monowarstwę podczas transcytozy.
Przenieś wkładkę do świeżej studzienki i zbierz podłoże z poprzedniej dolnej studzienki.
Umieść zebrane podłoże na płytce agarowej i inkubuj, aby rozwinąć kolonie bakterii.
Policz kolonie, aby określić zakres transcytozy E. coli przez barierę nabłonkową jelit.
Co 30 minut po inokulacji napełniaj nowe studzienki 500 mikrolitrami TCM bez antybiotyków i przenoś wkładki do tych nowych studzienek. Zebrać pożywkę z używanej studzienki zbiorczej dla każdej wkładki do osobnej oznakowanej probówki i umieścić probówkę na lodzie. Umieść płytkę Transwell z powrotem w inkubatorze między punktami czasowymi.
Dla każdej wkładki połącz zebrane media z różnych punktów czasowych i krótko wiruj. Umieść zebrane pożywki na płytkach ślimaka LB przy użyciu metody rozcieńczania ścieżek w celu ilościowego określenia liczby transcytozy bakterii w ciągu pierwszych dwóch godzin eksperymentu. Zebrać pożywkę po czterech i sześciu godzinach.
Dodatkowo, po sześciu godzinach, płytka z płytek z dołków kontrolnych. Po sześciu godzinach zmierz i zapisz TEER. Po całonocnej inkubacji należy ręcznie policzyć kolonie bakteryjne na płytkach LB do rozcieńczania torów.