JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Microbiology
0 wyświetleń • 2:43 min. • September 26th, 2025
Zacznij od znakowanych radioaktywnie ekstraktów nukleotydowych uzyskanych z kultury bakteryjnej przed i po indukcji stresu.
Pod wpływem stresu enzymy bakteryjne przekształcają trifosforan guanozyny i difosforan guanozyny w indukowane stresem nukleotydy pentafosforan guanozyny i tetrafosforan guanozyny.
Ekstrakty należy umieścić na cienkowarstwowej płytce chromatograficznej wstępnie pokrytej polimerem kationowym jako fazą stacjonarną.
Umieść płytkę w komorze zawierającej bufor jako fazę ruchomą, upewniając się, że ciecz pozostaje poniżej miejsca, aby zapobiec wczesnej dyfuzji.
Pozwól buforowi wznosić się przez działanie kapilarne, rozdzielając ujemnie naładowane nukleotydy na odrębne pasma w zależności od ich ładunku i rozmiaru.
Po wywołaniu zdejmij płytkę, wysusz na powietrzu i przytnij górę, aby wyeliminować wolne izotopy i zmniejszyć sygnał tła.
Wystaw płytkę na ekran wrażliwy na promieniowanie, aby wykryć sygnał radioaktywny.
Zwiększone poziomy tetrafosforanu guanozyny i pentafosforanu guanozyny po indukcji stresu ujawniają dynamiczne zmiany w puli nukleotydów guanozyny.
Najpierw ułóż płytkę TLC z celulozy PEI o wymiarach 20 na 20 centymetrów.
Użyj nożyczek, aby usunąć górne pięć centymetrów i użyj miękkiego ołówka, aby zaznaczyć linię początkową w odległości jednego centymetra od krawędzi. Nanieś pięciolitrową kroplę każdej próbki na powierzchnię PEI.
Zanim plamka będzie mogła wyschnąć, przenieś płytkę do zbiornika zawierającego warstwę 1,5 molowego fosforanu monopotasowego, która jest wystarczająco płytka, aby nie dotykać miejsca początkowego próbki. Przykryj zbiornik hermetycznym uszczelnieniem i pozwól, aby płyn dostał się do górnej części 15-centymetrowego przyciętego arkusza. Następnie usunąć w pełni rozwinięty chromatogram i wysuszyć go na powietrzu w temperaturze pokojowej.
Odciąć i wyrzucić górną część chromatogramu zawierającą wolny P32 do odpadów radioaktywnych. Za pomocą ekranu luminoforowego należy naświetlić filmy audioradiograficzne przez noc. Następnego dnia wywołaj film i użyj luminoforimagera, aby uchwycić i określić ilościowo zielony sygnał luminoforu.
Następnie użyj oprogramowania ImageJ, aby określić ilościowo plamy radioaktywne.