JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Microbiology
0 wyświetleń • 2:30 min. • September 26th, 2025
Zacznij od komórek E. coli dawcy zawierających plazmid F, w którym gen transferowy jest zastąpiony genem oporności na antybiotyki.
Komórki te zawierają również plazmid ratunkowy, który koduje brakujący gen transferu.
Weźmy równe objętości komórek biorcy E. coli z innym genem oporności na antybiotyki w swoim DNA.
Wymieszaj obie kultury w pożywce bez antybiotyków i inkubuj bez wstrząsania.
Plazmid ratunkowy bakterii dawcy wykazuje ekspresję genu transferowego, umożliwiając komórce dawcy zbudowanie F-pilusa.
Pilus tworzy most między dwiema komórkami, umożliwiając jednokierunkowy transfer plazmidu od dawcy do biorcy, tworząc transkoniuganty.
Wiruj mieszaninę, aby rozbić pary godowe i umieść ją na lodzie, aby zapobiec dalszemu kryciu.
Wykryć kulturę na płytkach agarowych zawierających przezkoniugowane antybiotyki do wyboru i inkubować.
Transkoniuganty, przenoszące oba geny oporności na antybiotyki, przeżywają i tworzą kolonie w obecności obu antybiotyków, potwierdzając udany transfer plazmidu F.
W dwóch egzemplarzach podwielokrotność 100 mikrolitrów komórek dawcy i 100 mikrolitrów komórek biorczych na 800 mikrolitrów sterylnej pożywki LB na jeden mililitr całkowitej objętości. Pozwól komórkom połączyć się w pary w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę bez wstrząsania. Po godzinie wiruj komórki przez 30 sekund, aby rozbić par godowych.
Następnie umieść komórki na lodzie na 10 minut, aby zapobiec dalszemu kryciu.
Wybierz dla transkoniugowanych komórek MC4100, które zawierają nokaut chloramfenikolu pOX38-Tc, zauważając dziesięć mikrolitrowych porcji każdego rozcieńczenia na każdej połowie płytek agarowych zawierających streptomycynę i chloramfenikol. Powtórz dla obu zduplikowanych mieszanin. Następnie inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.