Oczyszczanie rekombinowanych białek domeny P pochodzących z bakterii ludzkiego norowirusa

Weź kolumnę chromatograficzną wykluczającą rozmiar wypełnioną porowatymi sferycznymi kulkami żelowymi.

Zrównoważyć kolumnę buforem, który zachowuje integralność strukturalną białek podczas rozdzielania.

Załadować oczyszczony ekstrakt bakteryjny zawierający rekombinowane białka domeny domeny P ludzkiego norowirusa i resztkowe zanieczyszczenia białkowe.

Dodaj bufor, aby przepuścić próbkę przez kolumnę.

Duże zanieczyszczenia resztkowe nie mogą dostać się do porów i przejść przez przestrzenie między kulkami, najpierw eluując.

Monitoruj elucję za pomocą absorbancji UV. Mały pik wskazuje na zanieczyszczenia opuszczające kolumnę.

W przeciwieństwie do tego, małe białka domeny P dostają się do porów perełek, pokonują dłuższą drogę i wymywają się później. Wzrost piku absorbancji wskazuje na elucję białek domeny P.

Zebrać eluowane frakcje zawierające białka domeny P, które są teraz gotowe do dalszej analizy.

Umyć pompy i rury systemu oczyszczania wysokosprawnej chromatografii cieczowej i wstępnie zrównoważyć kolumnę chromatografii wykluczającej wielkość z żelowym buforem filtracyjnym. Wstrzyknąć domenę P do kolumny z szybkością przepływu jednego mililitra na minutę, używając superpętli lub pętli, w zależności od objętości zagęszczonej próbki. Po zakończeniu wstrzykiwania zwiększ natężenie przepływu do 2,5 mililitra na minutę.

Wraz ze wzrostem gęstości optycznej, a domena P schodzi z kolumny, zbieraj frakcje 1,5 mililitra. Domena P jest zwykle eluowana jako dimer.