JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Microbiology
0 wyświetleń • 3:15 min. • October 30th, 2025
Pobrać płytkę wielodołkową zawierającą genetycznie zmodyfikowane bakterie chorobotwórcze wyhodowane z różnymi związkami testowymi, wraz z kontrolami ujemnymi.
Bakterie są nosicielami plazmidu z genem kodującym białko zielonej fluorescencji lub GFP.
Promotor genu jest aktywowany przez białko, które reaguje na wewnątrzkomórkowe cykliczne stężenia di-GMP lub c-di-GMP.
Umieść płytkę w czytniku płytek.
Użyj kontroli ujemnej, która fluoryzuje maksymalnie ze względu na brak inhibitora c-di-GMP, aby dostosować ustawienia w celu optymalnego pomiaru sygnału fluorescencji.
Jeśli badany związek hamuje tworzenie c-di-GMP, wewnątrzkomórkowy poziom c-di-GMP zmniejsza się.
Obniżony poziom c-di-GMP wywołuje zmianę konformacyjną w białku, co prowadzi do represji promotora i niskiej ekspresji GFP, co skutkuje zmniejszoną fluorescencją.
Zmierz fluorescencję i przeanalizuj dane, aby zidentyfikować badane związki, które modulują wewnątrzkomórkowe poziomy c-di-GMP w bakteriach chorobotwórczych.
Około 30 minut przed pomiarem spektrofotometrycznym należy wstępnie ogrzać czytnik płytek do 37 stopni Celsjusza, aby uniknąć kondensacji. Przed czytaniem delikatnie zdejmij przepuszczającą powietrze uszczelkę pokrywy z płyty.
Następnie zmierz gęstość optyczną na długości fali 600 nanometrów przy ustawieniu 10 błysków na studzienkę i czasie ustalania 0,2 sekundy. Przed pomiarem fluorescencji należy dokonać automatycznej regulacji wzmocnienia i ogniskowej w oparciu o studzienkę kontroli ujemnej A24 i ustawić docelową wartość wzmocnienia na 75%.
Wybierz regulację ostrości i kanał A po prawej stronie okna. Zmierz fluorescencję z reportera GFP przy maksimum wzbudzenia 485 nanometrach i maksimum emisji 520 nanometrów, przy ustawieniu 10 błysków na studzienkę i czasie ustalania 0,2 sekundy.
Zbierz dane ze wszystkich badanych płyt. Odczyty danych są automatycznie zapisywane jako domyślne przez oprogramowanie sterujące czytnikiem płytek.
Aby przeanalizować dane, view odczyty, klikając ikonę Marsa w oprogramowaniu sterującym, aby otworzyć pakiet analizy statystycznej. Pobierz dane, klikając dwukrotnie interesujący Cię numer rejestracyjny, aby uzyskać dostęp do danych do analizy.
Oceń jednorodność i odtwarzalność testu za pomocą solidnej analizy Z prime.
Następnie oblicz procentowe zahamowanie wzrostu i oceń procentowe zahamowanie wewnątrzkomórkowego poziomu c-di-GMP, jak wyszczególniono w protokole tekstowym.