JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Microbiology
0 wyświetleń • 2:07 min. • October 30th, 2025
Pobrać oddzielne próbki żywych i martwych komórek Microcystis aeruginosa.
Wymieszaj próbki, aby utworzyć połączoną populację.
Microcystis zawiera fikocyjaninę, pigment autofluorescencyjny, który pozostaje nienaruszony w żywych komórkach, ale ulega degradacji w martwych komórkach.
Wirować próbkę, aby rozbić grudki i wytworzyć jednolitą, jednokomórkową zawiesinę.
Dodaj nieprzepuszczalną dla błony komórkowej, wiążącą kwasy nukleinowe sondę fluorescencyjną i inkubuj próbkę w ciemności, aby zapobiec fotowybielaniu.
Sonda selektywnie wnika do martwych komórek przez ich uszkodzone błony i wiąże się z wewnątrzkomórkowym DNA.
Przepuść próbkę przez cytometr przepływowy, aby zmierzyć autofluorescencję fikocyjaniny i fluorescencję sondy kwasów nukleinowych przy użyciu laserów o odpowiedniej długości fali wzbudzenia.
Żywe komórki emitują silną autofluorescencję fikocyjaniny, ale nie wykazują sygnału sondy.
W przeciwieństwie do tego, martwe komórki wykazują zmniejszoną emisję pigmentu i podwyższoną fluorescencję sondy, co potwierdza uszkodzenie błony.
Umożliwia to identyfikację bogatych w pigment żywych komórek od martwych komórek.
Aby zoptymalizować wychwyt komórek sondy molekularnej, należy wystawić połowę wcześniej przygotowanej monokultury na działanie odpowiednich warunków do wygenerowania martwej kontroli. Sprawdź zmiany w mikrośrodowisku próbki, aby potwierdzić śmierć kultury. A następnie zdezagreguj formację kolonii, jak właśnie pokazano.
Następnie wybierz laser o długości 488 nm wraz z detektorem, który może rejestrować fluorescencję z zielonych i pomarańczowych sond kwasów nukleinowych. I 640-nanometrowy laser do rejestrowania sygnałów fikocyjaniny przez odpowiednie detektory.