Synteza stabilizowanych nanodyskami antygenów białek błonowych przy użyciu systemu bezkomórkowego

Weźmy system bezkomórkowy bakteryjny, który nie ma nienaruszonych struktur komórkowych, ale zachowuje składniki molekularne niezbędne do transkrypcji i translacji in vitro .

Wprowadź plazmidy kodujące antygen białka błonowego i białko rusztowania, a także syntetyczne fosfolipidy i polimery.

Uzupełnij mieszaninę o ATP, GTP i mieszankę aminokwasów, aby zainicjować syntezę białek.

Jednocześnie należy przygotować roztwór paszowy wzbogacony o mieszankę aminokwasów.

Załadować mieszaninę do komory wewnętrznej, a roztwór zasilający do komory zewnętrznej dwukomorowego urządzenia do dializy.

Podczas inkubacji substraty dyfundują z komory zewnętrznej do wewnętrznej przez błonę półprzepuszczalną, ułatwiając transkrypcję plazmidu i translację białek.

Białko rusztowania składa fosfolipidy i polimery w nanodyski lipidowe i ułatwia fałdowanie i włączanie MPA do tych struktur.

Produkty uboczne powstające podczas reakcji dyfundują do komory zewnętrznej, utrzymując optymalne warunki do tworzenia się MPA stabilizowanego nanodyskami.

Przygotuj MOMP-tNLP, stosując metodę bezkomórkową.

Rozmrozić bufor do rozpuszczenia z zestawu do ekspresji białek bezkomórkowych na dwie godziny przed rozpoczęciem reakcji i dodać do buforu inhibitor proteazy wolny od EDTA. Użyj zestawu zaprojektowanego do przeprowadzenia pięciu jednomililitrowych reakcji. Na każdą jednomililitrową reakcję dodać 525 mikrolitrów buforu do rozpuszczenia do butelki z lizatem E. coli i zwinąć ją do rozpuszczenia.

Dodać 250 mikrolitrów buforu do rozpuszczenia do butelki reakcyjnej zawierającej dodatek i rozpuścić przez walcowanie. Następnie dodaj 8,1 mililitra buforu do rozpuszczania do butelki z reakcją i zwiń ją do rozpuszczenia. Do butelki z mieszaniną aminokwasów dodać trzy mililitry buforu do rozpuszczenia, aby go rozpuścić.

Do innej butelki metioniny dodaj 1,8 mililitra buforu do rozpuszczania, rozpuść go i przechowuj na lodzie. Dodać 225 mikrolitrów odtworzonej mieszaniny, 270 mikrolitrów odtworzonej mieszaniny aminokwasów bez metioniny i 30 mikrolitrów odtworzonej metioniny do butelki z lizatem. Następnie dodać 400 mikrolitrów mieszaniny DMPC / telodendrymer, 15 mikrogramów plazmidu MOMP i 0,6 mikrograma delta-49 ApoA1 do mieszaniny i wymieszać.

Podwielokrotność 20 mikrolitrów całkowitego roztworu w probówce o pojemności 1,5 mililitra Do reakcji kontrolnej z ekspresją GFP. Przygotować roztwór paszowy, dodając 2,65 mililitra odtworzonej mieszaniny aminokwasów bez metioniny i 300 mikrolitrów odtworzonej metioniny. Przenieś jeden mililitr roztworu reakcyjnego do wewnętrznej komory reakcyjnej w bezkomórkowym zestawie reakcyjnym i zamknij go.

Napełnij zewnętrzną komorę naczynia reakcyjnego 10 mililitrami roztworu pokarmowego i zamknij ją. Dodać 0,5 mikrolitra plazmidu kontrolnego GFP do 20-mikrolitrowych podwielokrotności mieszaniny reakcyjnej. Umieść reakcję w wytrząsarce z prędkością 300 obrotów na minutę przez 18 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Monitorować reakcję pod światłem UV po 15 minutach pod kątem fluorescencji spowodowanej syntezą GFP.