Miękki test agarowy do wykrywania zabijania podsycaniego bakteriocyną u strzykawek Pseudomonas

Zacznij od stopionego, miękkiego agaru utrzymywanego w ciepłej temperaturze.

Zaszczep hodowlę Pseudomonas syringae , szczepu testowego, do agaru.

Następnie krótko przewij, aby równomiernie rozłożyć komórki.

Wlej mieszankę na zastygłą płytkę agarową i rozsmaruj równomiernie.

Zamknij pokrywkę i pozwól zastygnąć.

Na powierzchni stwardniałego agaru znalazł się przefiltrowany supernatant.

Supernatant zawiera bakteriocynę, cząsteczkę przeciwbakteryjną, pochodzącą ze szczepu P. syringae wywołanego stresem.

Inkubuj płytkę, aby umożliwić wzrost bakterii i dyfuzję bakteriocyny przez agar.

Bakteriocyna wiąże się z konkretnymi receptorami powierzchniowymi szczepu testowego i zakłóca jego błonę, prowadząc do śmierci komórki.

Skutkuje to powstaniem strefy przezroczystej na agarze, wskazującej obszar, w którym szczep testowy został zniszczony przez antybakteryjną cząsteczkę bakteriocynę.

Rozcieńcz kulturę 1 do 100 do świeżej KB. Inkubuj hodowlę przez trzy do czterech godzin, potrząsając w temperaturze pokojowej. Następnie przygotuj sterylny agar wodny, podkładając zawiesina agaru w ultraczystej wodzie.

Przed użyciem utrzymuj stopiony miękki agar w kąpieli wodnej o temperaturze 60 stopni Celsjusza. Za pomocą sterylnej pipety serologicznej przelej trzy mililitry miękkiego agaru do sterylnej rurki hodowlanej. Wróć tubkę do kąpieli wodnej, aby utrzymać ją w stanie stopionym.

Przed wylaniem nakładki pozwól stopionemu agarowi ostygnąć, ale nie pozwól mu się zastygnąć.

Kluczowe jest, aby agar był utrzymywany w gorącym, całkowicie stopionym stanie przed szczepieniem. Jeśli nie, nakładka będzie miała ziarnisty wygląd i będzie trudniejsza do interpretacji.

W sterylnym kapturze zaszczep 100 mikrolitrów kultury testowej do miękkiego agaru i wiru w celu wymieszania. Obróć hodowlę ręcznie przez 10 do 15 sekund, a następnie wylej ją na dno płytki agarowej. Przechyl płytkę we wszystkich kierunkach, aby miękki agar równomiernie pokrywał dolny agar.

Przykryj talerz i pozwól mu 20 do 30 minut, by się zastygł. Uważaj, aby nie poruszyć płyty podczas zastygnięcia. Po zastygnięciu nałóż na nakładkę od dwóch do pięciu mikrolitrów supernatantu.

Pozwól płytkom wysiąść się przez noc w temperaturze pokojowej. Obserwuj i zapisuj wyniki następnego ranka. Przy tej metodzie dwa szczepy P. syringae są hamowane przez różne bakteriocyny. Szczep A jest wrażliwy na bakteriocynę o wysokiej masie cząsteczkowej, tailocynę, ale nie jest wrażliwy na alternatywną, niskocząsteczkową bakteriocynę.