Wykrywanie ekspresji docelowych enzymów w genetycznie modyfikowanych komórkach bakteryjnych

Zacznij od rurek zawierających genetycznie modyfikowane komórki bakteryjne. Każda bakteria zawiera fosmidy o wysokiej jakości kopiowania, które kodują różne enzymy.

Inkubuj rurki poprzez potrząsanie w celu ułatwienia ekspresji różnych enzymów wewnątrzkomórkowych.

Dodaj do probówki substrat specyficzny dla docelowego enzymu i dodaj równą objętość buforu do probówki kontrolnej.

Inkubuj z drżeniem. Substrat wchodzi do komórek, gdzie enzymy docelowe go rozszczepiają i wytwarzają produkt fluorescencyjny.

Załaduj rurkę sterującą do cytometru przepływowego z prekaliserią.

Gdy każda komórka przechodzi przez wiązkę lasera, rozprasza ona światło. Wygeneruj wykres rozproszenia, aby zidentyfikować pojedyncze komórki, które rozpraszają mniej światła niż skupiska.

Wyklucz skupiska komórek i wykreśl sygnał fluorescencji pojedynczych komórek, aby ustalić fluorescencję bazową.

Umieść rurkę impregnowaną podłożem w cytometrze przepływowym, aby zmierzyć sygnał fluorescencji.

Zwiększony sygnał fluorescencji w komórkach poddanych substratom w porównaniu z komórkami kontrolnymi potwierdza ekspresję docelowego enzymu.

Aby przesiewać interesujące się enzymy metagenomowe, inkubuj posortowane komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min, aż OD₆₀₀ osiągnie 0,5. Następnie dodaj 1 mikrolitr roztworu indukcyjnego kopiowania, aby wzmocnić wewnątrzkomórkową liczbę kopii fosmidów.

Po trzech godzinach w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 250 obr./min połącz 0,5 mililitra komórek z odpowiednim substratem w 14-mililitrowej probówce z okrągłym dnem do końcowego stężenia 100 mikromolarów. Następnie inkubuj próbki kontrolne i eksperymentalne w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min przez kolejne trzy godziny.

Podczas gdy próbki się trzęsą, ustaw parametry maszyny FACS tak, jak właśnie pokazano. Następnie należy dodać 5 mikrolitrów komórek z każdej próbki do pojedynczych 5-mililitrowych probarek z okrągłym dnem zawierającym 1 mililitr PBS. Następnie załaduj komórki próbki i ustaw częstotliwość zdarzeń na 1000 do 3000 zdarzeń na sekundę.

Stwórz logaritagonitalnie skalowany obszar rozpraszania w kierunku przedniego w porównaniu do logaritologicznego obszaru bocznego rozpraszania i dostosuj bramkę rozpraszania R1, aby objąć komórki bakteryjne zdarzenia singletowego. Następnie stwórz logarytmicznie skalowany wykres rozpraszania w kierunku FITC i ustaw bramkę sortowania R2 tak, aby wykrywać mniej niż 0,1% komórek ujemnych. Teraz załaduj probówkę i dostosuj częstotliwość zdarzeń do 1000 do 3000 zdarzeń na sekundę, w razie potrzeby.