JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Microbiology
0 wyświetleń • 3:21 min. • February 26th, 2026
Zacznij od szalki Petriego zawierającej współkulturę Bdellovibrio bacteriovorus, drapieżnej bakterii, oraz E. coli, jej ofiary, pod agarozową poduszką.
Agarozowa poduszka unieruchamia E. coli , podczas gdy B. bacteriovorus pozostaje ruchoma i aktywnie atakuje komórki ofiary.
Drapieżnik wyraża czerwony marker cytoplazmatyczny oraz zielony znacznik fluorescencyjny połączony z podjednostką polimerazy DNA w celu wizualizacji.
Zabezpiecz naczynie w uchwycie i nałóż olej immersyjny na podstawę miszki oraz obiektyw mikroskopu dla optymalnej rozdzielczości.
Zamontuj uchwyt na mikroskopie i skonfiguruj go do detekcji fluorescencji dwukanałowej.
Użyj optyki jasnego pola do zlokalizowania płaszczyzny ogniskowej i wybierz wiele nienakładających się pól obrazowania.
Ustawiaj parametry time-lapse, aby rejestrować zarówno obrazy w świetle, jak i fluorescencyjne sekwencyjnie w określonych odstępach czasu.
Metoda ta umożliwia obserwację drapieżnictwa zaczynającego od przyczepienia i inwazji ofiary, następnie transformacji komórek ofiary, wzrostu włóknistego, septacji, formowania potomstwa, a kończąc na lizie komórek ofiary.
W mikroskopii poklatkowej Florescence kokultury umieść naczynie w pojemniku na szalkę Petriego tak, aby naczynie nie przesuwało się podczas eksperymentu, i umieść jedną kroplę oleju immersyjnego na obiektywie mikroskopu odwróconego, a jedną na dnie naczynia. Zamontuj uchwyt na stole mikroskopu w komorze odwróconej mikroskopu, a w oprogramowaniu mikroskopu ustaw powiększenie na 100X, a soczewkę polichromową na GFP i mCherry. Używając okularu w Brightfield, zlokalizuj płaszczyznę ogniskową i otwórz menedżera listy.
Przesuń scenę i użyj przycisku Oznacz Punkty , aby zapisać współrzędne co najmniej 10 interesujących miejsc. Przełącz zawór kamery z okularu na monitor. Ustaw płaszczyznę ogniskową i kliknij przycisk Zamień punkt w menedżerze listy, aby skalibrować każdy punkt.
Otwórz projektanta eksperymentu i odznacz pudełko do układania chorób. Wybierz odpowiednie kanały fluorescencyjne oraz optymalne ustawienia oświetlenia, a następnie ustaw odstępy między akwizycją obrazu a całkowitym czasem trwania eksperymentu. Włącz utrzymanie ostrości dla wybranych pozycji i wybierz folder danych, w którym pliki obrazów powinny być automatycznie zapisane.
Sprawdź ponownie wszystkie ustawienia w oprogramowaniu mikroskopu i rozpocznij eksperyment time-lapse. Po pierwszej godzinie eksperymentu sprawdź, czy wszystkie pozycje scen są nadal ostre. Po zakończeniu eksperymentu time-lapse usuń szalkę Petriego i wyrzuć 35-milimetrową miskę z agarozową podkładką zgodnie z odpowiednimi protokołami bezpieczeństwa biologicznego.