JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Microbiology
0 wyświetleń • 4:02 min. • February 26th, 2026
Weź podłoże zawierające antybiotyk blokujący podziały komórkowe.
Zaszczep ją pręcikowatym, Gram-ujemnymi bakteriami.
Inkubuj z drżeniem.
W obecności antybiotyku bakterie nadal rosną bez podziału i tworzą długie włókna.
Zbierz hodowlę i odwiruj ją w niskiej temperaturze. Usuń supernatant i przemyj filamenty roztworem sacharozy, aby zapobiec lizie.
Wyrzuć roztwór sacharozy.
Dodaj bufor, a następnie enzymy i EDTA. EDTA osłabia błonę zewnętrzną, umożliwiając lizoenzymowi wejście i rozłożenie warstwy peptydoglikanu.
Usuwa to ścianę komórkową, pozwalając komórce bakteryjnej się kurczyć. DNaza I rozbija uwolnione chromosomowe DNA z komórek i zapobiega zlepianiu się komórek.
Dodaj roztwór hipotoniczny z delikatnym wirowaniem, pozwalając komórce pobierać wodę.
Elastyczne błony pozwalają komórce przybrać kulisty kształt zwany sferoplastem.
Przełóż aliquot zawierający sferoplasty do dwóch rurek z schłodzonym roztworem izotonicznym, aby ustabilizować sferoplasty.
Aby przygotować sferoplasty E.coli Gram-ujemne , rozcieńcz nocną hodowlę w proporcji 1 do 100 w 25 mililitrach TSB w kolbce 250 mililitrów, a bakterie z powrotem do inkubatora wstrząsającego na kolejne 2,5 godziny. Gdy roztwór osiągnie gęstość optyczną 0,5 do 0,8 w 600 nanometrach, rozcieńcz hodowlę w stosunku 1 do 10 w świeżym TSB w nowej kolbie 250 mililitrów na drugą inkubację trwającą 2,5 godziny z końcowym stężeniem efektywnym 60 mikrogramów na mililitr cefaleksyny.
Aby wyprodukować jednokomórkowe włókna o długości około 50 do 150 mikrometrów, widoczne pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 1000x. Wiruj roztwór bakteryjny, aby zebrać filamenty i przelewać supernatant. Opłucz włókna delikatnym dodatkiem jednego mililitra sacharozy 0,8 molowej, uważając, aby nie naruszyć granulki.
Po minucie odrzuć supernatant bez zakłócania granulki i dodaj wskazane odczynniki w odpowiedniej kolejności do filamentów. Po dziesięciu minutach w temperaturze pokojowej stopniowo dodawaj jeden mililitr roztworu A przez minutę, delikatnie mieszając roztwór ręcznie. Inkubuj roztwór przez cztery minuty w temperaturze pokojowej, a następnie podziel zawiesinę włókna na dwie równe aliquoty między dwoma stożkowymi rurkami o pojemności 15 mililitrów zawierającymi siedem mililitrów roztworu B o czterech stopniach Celsjusza. Następnie osusz filamenty przez wirowanie i użyj pipety serologicznej, aby ostrożnie usunąć wszystkie oprócz jednego do dwóch mililitrów supernatantu, nie naruszając granulek.
Użyj mikropipety p1000, aby delikatnie zawiesić pellety. Sprawdź niewielką aliquot próbki pod kątem tworzenia sferoplastów mikroskopem świetlnym. Sferoplast można następnie przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez maksymalnie tydzień lub do trzech cykli mrozu i rozmrażania.