Wykrywanie podatności na antybiotyki bakteryjne za pomocą stymulowanego mikroskopu rozpraszającego Ramana

Zacznij od próbek bakteryjnych wcześniej obtraktowanych rosnącym stężeniem antybiotyku, który eliminuje podatne bakterie.

Do odpowiednich probówek dodaj podłoże wzrostu zawierające tlenek deuteru i to samo stężenie antybiotyku.

Inkubuj rurki w warunkach drżących.

Tlenek deuteru wnika do komórek bakteryjnych, gdzie deuter zostaje włączony do nowo zsyntetyzowanych biomolekuł, tworząc wiązania węgiel–deuter.

Rozprowadź bakterie, wyrzuć supernatant i umyj.

Dodaj utrwalający, aby zachować strukturę bakterii.

Dodaj wodę, wiruję i usuń supernatant.

Ponownie zawiesnij bakterie i przenieś zawiesinę na szkło pokryte poli-L-lizyną, a następnie je uszczelnić.

Umieść próbkę na stole prekalibrowanego mikroskopu stymulowanego Ramana lub SRS. Dodaj wodę i obniż cel.

Zrób zdjęcia wielu pól w celu oceny częstotliwości drgań węgla i deuteru.

Przy wyższych stężeniach antybiotyków sygnał węgiel–deuter maleje, co wskazuje na obniżoną żywotność bakterii.

Umożliwia to szybką ocenę podatności na antybiotyki poprzez korelację intensywności sygnału SRS z żywotnością bakterii.

Po godzinie inkubacji należy dodać 700 mikrolitrów antybiotyku szerejnie rozcieńczonego z 100% deuterem zawierającym podłoże MHB do 300 mikrolitrów bakterii wcześniej obtraktowanych antybiotykiem w tym samym stężeniu antybiotyku. Ujednolicaj mieszankę, pipetując w górę i w dół kilka razy. Dodaj 700 mikrolitrów bezantybiotykowego medium zawierającego deuter zawierający MHB do 300 mikrolitrów bakterii wolnych od antybiotyków jako kontrolę pozytywną.

Dodaj 700 mikrolitrów bezantybiotykowego medium zawierającego deuter zawierający 0% MHB do 300 mikrolitrów bakterii wolnych od antybiotyków jako kontrolę negatywną. Inkubuj wszystkie mikrorurki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obrotów na minutę przez 30 minut. Po inkubacji wiruj 1 mililitr antybiotyku i deuteru w dawce 6200 g przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie dwukrotnie umyj granulat wodą oczyszczoną. Utrwal próbki w roztworze formaliny 10% objętościowej i przechowywał je w 4 stopniach Celsjusza.

Do przygotowania próbki przemyj 1 mililitr roztworu ustalonych bakterii wodą oczyszczoną i wiruj roztwór roztworu bakterii w 6 200 g przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Usuń supernatant i wzbogać roztwór bakteryjny do około 20 mikrolitrów sterylizowaną wodą. Roztwór bakteryjny nałóż na szkło pokrywkowe pokryte poli-L-lizyną, następnie załóż kolejne szkło pokrywkowe i zabezpiecz próbkę. Umieść próbkę bakterii na etapie próbki pod obiektywem do zanurzenia w wodzie 60x. Rozpocznij obrazowanie SRS próbek bakteryjnych. Zrób zdjęcia co najmniej trzech pól widzenia dla każdej próbki.