Dostarczanie genów na podstawie rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem: technika dostarczania transgenu i ekspresji specyficznej dla serca w modelu gryzoni

Rekombinowany wirus związany z adenowirusem, rAAV, jest małym, jednoniciowym wirusem DNA genetycznie zmodyfikowanym w celu celowania w określony typ komórki i transportu jego ładunku genetycznego do jądra komórki gospodarza w celu ekspresji genów.

Zacznij od unieruchomienia znieczulonego kriogenicznie szczeniaka myszy. Wysterylizuj skórę pleców i wstrzyknij podskórnie wektor rAAV przenoszący pożądany transgen wzdłuż promotora specyficznego dla serca. Wektor zostaje wchłonięty przez układ naczyniowy i dociera do odległych narządów, w tym do serca.

W tym przypadku rekombinowany wirus przyczepia się do powierzchni kardiomiocytu i zostaje zinternalizowany przez endocytozę do endosomu. W endosomie kapsyd wirusa częściowo się rozkłada, odsłaniając białka lityczne wirusa. Białko to indukuje pory w błonie endosomalnej, przez które wektor ucieka do cytoplazmy.

Wektor przemieszcza się przez mikrotubule cytoplazmatyczne i wchodzi przez pory jądrowe. Po dostaniu się do jądra kapsyd wirusa rozkłada się, aby uwolnić swój genom. Jednoniciowy DNA przenoszący gen docelowy jest następnie przekształcany w dwuniciowy DNA.

Po transkrypcji DNA wytworzone mRNA przemieszcza się do cytoplazmy. Tutaj mRNA ulega translacji, wyrażając docelowe białko w kardiomiocytach. Obserwuj próbki tkanek z różnych narządów pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby określić skuteczność i specyficzność tkankową dostarczania genu do serca.

Po ustaleniu miana wirusa zgodnie z protokołem tekstowym należy przygotować roztwory robocze rAAV9 z mianem wirusa 1-7 x 10¹² cząstek na mililitr. Aby leczyć nowonarodzone myszy, użyj roztworu rAAV9, aby wstępnie napełnić strzykawkę insulinową o wymiarach 0,33 x 12,7 mililitra igłą o rozmiarze 29 x 1/2 cala, unikając pęcherzyków powietrza.

Po krioznieczuleniu szczeniaka trzymaj szczeniaka w jednej ręce kciukiem i palcem wskazującym. Następnie przetrzyj tylną skórę szczeniaka patyczkiem do wacików nasączonym 70% alkoholem izopropylowym. Wprowadzić igłę strzykawki do przedniego grzbietowo-grzbietowego tkanki podskórnej zwierzęcia pod kątem od 5 do 10 stopni przed wstrzyknięciem od 50 do 70 mikrolitrów roztworu rAAV9.