JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Biological Techniques
0 wyświetleń • 3:43 min. • July 8th, 2025
Zacznij od fluorescencyjnego kodowania białka plazmidowego DNA lub zawiesiny pDNA w pożywce. Dodaj biokompatybilne, pokryte kationowym polimerem nanocząstki magnetyczne do zawiesiny pDNA i inkubuj.
Dodatnio naładowane polimery kationowe oddziałują elektrostatycznie i sprzęgają się z ujemnie naładowanym pDNA, powodując kondensację pDNA i tworzenie "magnetycznych polipleksów" o ogólnym ładunku dodatnim.
Teraz przenieś mieszaninę polipleksów na wielodołkową płytkę zawierającą przylegającą pierwotną hodowlę komórek neuronalnych myszy. Zamontuj płytkę wielodołkową na płytce magnetycznej i inkubuj.
Pole magnetyczne generowane przez płytę magnetyczną powoduje, że polipleksy osadzają się i gromadzą na powierzchni komórki neuronalnej. Ten bliski kontakt z powierzchnią komórki ułatwia niespecyficzne wiązanie dodatnio naładowanych polipleksów z ujemnie naładowanymi proteoglikanami związanymi z błoną komórkową.
Następnie polipleksy ulegają internalizacji poprzez endocytozę - proces, w którym lokalne obszary błony komórkowej wnikają i szczypią się, tworząc pęcherzyki związane z błoną zwane endosomami.
Wewnątrz cytoplazmy polimery kationowe polipleksu indukują akumulację protonów w endosomie. Jednoczesny napływ jonów chlorkowych w celu utrzymania neutralności ładunku zwiększa endosomalną siłę jonową, prowadząc do napływu wody.
W końcu endosomy pęcznieją i pękają pod wpływem ciśnienia osmotycznego, uwalniając polipleksy do cytoplazmy. Skondensowane pDNA w polipleksach ułatwiają zwiększoną ruchliwość cytozolową, podczas gdy polimery kationowe chronią pDNA przed degradacją nukleazy cytoplazmatycznej.
Po dysocjacji polipleksów, uwolnione pDNA - podczas odpowiedniej fazy cyklu komórkowego, gdy błona jądrowa tymczasowo się rozpada - ulega translokacji do jądra. Komórki z powodzeniem transfekowane pDNA wykazują ekspresję białek fluorescencyjnych.
Aby wyhodować neurony ruchowe, rozcieńcz je do 5 000 do 10 000 komórek w 500 mikrolitrach pożywki hodowlanej na dołku na 24-dołkowej płytce. Następnie usuń roztwór laminatu za pomocą końcówki do pipety P1000. Neurony ruchowe rozcieńczone w pożywce hodowlanej należy natychmiast przenieść na płytki powlekające, aby uniknąć wysuszenia.
Aby przygotować DNA, ponownie zawieś 1 mikrogram DNA w 50 mikrolitrach pożywki do hodowli neuronów i wiruj przez 5 sekund. Aby przygotować rurkę z kulkami, ponownie zawieś 1,5 mikrolitra kulek w 50 mikrolitrach pożywki do hodowli neuronów. Dodaj 50 mikrolitrów roztworu kulek do 50 mikrolitrów roztworu DNA i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
Podczas tej inkubacji należy pobrać 100 mikrolitrów pożywki hodowlanej ze studzienki, która będzie transfekowana. Następnie przenieś 100 mikrolitrów mieszanki kulek DNA do każdej studzienki i inkubuj 24-dołkową płytkę przez 20 do 30 minut na płytce magnetycznej w temperaturze 37 stopni Celsjusza.