JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Biological Techniques
0 wyświetleń • 3:36 min. • July 8th, 2025
Aby zbadać interakcję między białkiem wiążącym fosfolipidy a dwuwarstwą lipidową za pomocą mikrograwimetrii dyssypatywnej, należy wziąć mikrowagę z czujnikiem kwarcowym. Po przyłożeniu odpowiedniego napięcia warstwa kwarcu - umieszczona między dwiema metalowymi elektrodami - oscyluje z określoną częstotliwością.
Dodać zawiesinę małych jednowarstwowych pęcherzyków — składających się z pojedynczej dwuwarstwy lipidowej — do czujnika. Pęcherzyki adsorbują się na pokrytej krzemionką powierzchni hydrofilowej, zwiększając masę czujnika i proporcjonalnie zmniejszając jego częstotliwość oscylacji.
Pęcherzyki wypełnione buforem działają jak warstwa lepkosprężysta, prowadząca do rozpraszania - tłumienia oscylacji. Zaadsorbowane pęcherzyki pękają, uwalniając zamknięty bufor. Wynikający z tego spadek masy zwiększa częstotliwość oscylacji.
Pęknięte pęcherzyki tworzą ciągłą dwuwarstwę, naśladującą błonę biologiczną. Sztywność dwuwarstwy zmniejsza rozpraszanie.
Dodać bufor zawierający jony wapnia wraz z białkiem docelowym. Jony wapnia wiążą się z białkiem i zmieniają jego konformację, umożliwiając wiązanie się z cząsteczkami lipidów w dwuwarstwie.
Wiązanie białek zwiększa masę czujnika, co prowadzi do zmniejszenia częstotliwości. Integralność strukturalna dwuwarstwy pozostaje nienaruszona, co powoduje jedynie niewielki wzrost rozpraszania.
Dodaj czynnik chelatujący, aby chelatować jony wapnia - dysocjując białka od dwuwarstwy.
Brak związanych białek przywraca częstotliwość i rozproszenie oscylacji do poziomów niezwiązanych z białkiem - potwierdzając, że wiązanie jest wyłącznie zależne od wapnia i że dwuwarstwa pozostaje nienaruszona.
Ostrożnie zanurz oczyszczone plazmowo czujniki w czterech komorach przepływowych za pomocą pęsety. Unikaj naciskania lub skręcania komór i rurek, które mogą powodować wycieki. Przepłukać system buforem cytrynianowym w trybie otwartego przepływu przez 10 minut.
Uruchom program. Rozpocznij rejestrowanie wszelkich zmian częstotliwości i rozpraszania pierwszego podstawowego tonu i alikwotów za pomocą oprogramowania, aż linie bazowe częstotliwości i rozpraszania ustabilizują się.
Gdy linie podstawowe są stabilne, zastosuj zawiesinę SUV w buforze cytrynianowym. Za pomocą naczynia reakcyjnego usuń 1,5 mililitra martwej objętości. Następnie zamknij system w trybie przepływu pętlowego. Rejestruj przesunięcie rozpraszania częstotliwości przez kolejne 10 minut.
Gdy SLB jest stabilny, należy zrównoważyć układ z pracującym buforem przy wymaganych stężeniach wapnia w trybie otwartego przepływu przez 40 minut. Dodać białko do buforu biegowego zawierającego wapń. Aplikację białka należy wykonywać w trybie przepływu pętlowego, aż do osiągnięcia stanu równowagi.