JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunology
0 wyświetleń • 3:06 min. • July 8th, 2025
Zacznij od płytki zawierającej kulturę pierwotnych makrofagów.
Wprowadź bakteryjny lipopolisacharyd, LPS, który wiąże się z receptorami toll-podobnymi na makrofagach, wywołując regulację w górę białka z rodziny NLR zawierającego domenę piryny 3 lub NLRP3.
Dodaj jonofor, który pośredniczy w wypływie jonów potasu. Obniżony potas cytozolowy aktywuje NLRP3. Aktywowany NLRP3 oligomeryzuje i indukuje rekrutację białka adaptorowego, które z kolei rekrutuje pro-kaspazę-1, tworząc inflamasom.
Autoproteoliza przekształca pro-kaspazę-1 w aktywną kaspazę-1, która pośredniczy w zapalnej śmierci komórek lub piroptozie. Uszkodzenie DNA podczas piroptozy prowadzi do kondensacji jądrowej.
Napraw komórki i potraktuj detergentem, aby je przepuszczalności.
Dodaj przeciwciało pierwszorzędowe wiążące się z białkiem adaptorowym związanym z inflamasomem oraz znakowane fluorescencyjnie przeciwciało drugorzędowe, które wiąże się z przeciwciałem pierwotnym, znakując inflamasom.
Wprowadź fluorescencyjne barwienie kwasem nukleinowym, aby oznaczyć jądro. Pod mikroskopem fluorescencyjnym komórki wykazują skondensowane jądra - wskazujące na piroptozę - i ogniska białek adaptorowych - wskazujące na tworzenie się inflamasomów.
W celu analizy immunofluorochemicznej komórek traktowanych nigerycyną, umyj komórki znakowane sondą i inkubuj komórki w 250 mikrolitrach roztworu utrwalającego i przepuszczalnego na studzienkę przez 30 minut na lodzie, chroniony przed światłem.
Przemyj makrofagi jeszcze trzy razy świeżym buforem do płukania i oznacz komórki 250 mikrolitrami pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko białemu podobnemu do plamki związanego z apoptozą, zawierającemu C-końcową domenę rekrutacyjną kaspazy lub ASC, na studzienkę przez jedną godzinę na lodzie.
Umyć komórki pod koniec inkubacji i oznaczyć próbki 250 mikrolitrami odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z barwnikiem fluorescencyjnym przez kolejną godzinę na lodzie, dodając 4 mikrolitry odpowiedniego fluorescencyjnego barwnika do barwienia jądrowego w ciągu ostatnich 5 minut.
Po 3-krotnym umyciu komórek w buforze do płukania na zimno, zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach z 7 mikrolitrami podłoża mocującego zapobiegającego blaknięciu, jak pokazano, i zobrazuj makrofagi za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej.