Barwienie komórek bakteryjnych i przygotowanie do badań immunologicznych

Zacznij od probówki zawierającej kulturę bakteryjną w fazie wykładniczej, zapewniając jednolite i aktywnie rosnące bakterie w celu uzyskania spójnych wyników.

Odwirować w celu zebrania komórek; zassać supernatant zawierający szczątki i ponownie zawiesić komórki.

Wprowadź przepuszczalny dla komórek czerwony barwnik fluorescencyjny. Cząsteczki barwnika przenikają przez błonę komórkową bakterii i docierają do nukleoidu, wiążąc się z DNA i nadając bakteriom czerwoną fluorescencję.

Odwirować w celu osadzenia barwionych bakterii i odessać niezwiązany supernatant zawierający barwnik.

Ponownie zawiesić bakterie w pożywce wzrostowej, aby utrzymać żywotność komórek.

Za pomocą fotometru zmierz absorbancję rozcieńczonej zawiesiny bakteryjnej na głębokości 600 nanometrów.

Porównaj wartość absorbancji z krzywą wzorcową, aby określić stężenie bakterii.

Przenieś żądaną objętość barwionej zawiesiny bakteryjnej do świeżej probówki zawierającej pożywkę wzrostową. Ma to na celu osiągnięcie pożądanego stężenia bakterii dla infekcji komórek gospodarza reprezentujących wielokrotność infekcji lub MOI.

Barwione bakterie z pożądanym MOI są gotowe do badań immunologicznych.

Najpierw zbierz kultury bakteryjne w fazie wykładniczej przez odwirowanie 13 000 razy g przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Po umyciu osadu komórkowego jednym mililitrem PBS, ponownie zawieś osad bakteryjny w jednym mililitrze PBS.

Określ stężenia zawiesiny bakteryjnej, mierząc gęstość optyczną przy 600 nanometrach. Następnie, w celu zabarwienia zawiesiny bakteryjnej, dodaj dwa mikrolitry 500-krotnie skoncentrowanego zielonego lub czerwonego barwnika barwiącego do jednego mililitra zawiesiny bakteryjnej, aby rozcieńczyć barwnik jednokrotnie. Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez 30 minut z delikatnym obracaniem w ciemności.

Po 30 minutach odwirować wybarwione bakterie 13 000 razy g przez dwie minuty i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze PBS. Zebrać wybarwione komórki bakteryjne przez odwirowanie w ilości 13 000 g przez dwie minuty. Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze świeżej pożywki F-12K i zmierzyć gęstość optyczną każdej kultury na 600 nanometrach. Następnie rozcieńczyć kultury do pożądanych stężeń, w oparciu o wielokrotność infekcji i stężenie komórek gospodarza.