JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunology
0 wyświetleń • 3:54 min. • July 8th, 2025
Rozpocznij od umieszczenia szklanego szkiełka z przylegającą monowarstwą śródbłonka stymulowaną cytokinami w komorze przepływowej.
Te komórki śródbłonka wyrażają cząsteczki adhezyjne powierzchniowe, takie jak selektyny, i sygnały migracyjne związane ze śródbłonkiem, takie jak chemokiny.
Wprowadzić znakowane fluorescencyjnie leukocyty do komory przepływowej.
Gdy leukocyty przepływają przez monowarstwę śródbłonka, angażują się w aktywowane komórki śródbłonka.
Selektyny na komórkach śródbłonka wiążą się z odpowiadającymi im ligandami na leukocytach.
Oddziaływania selektoryna-ligand są słabe i przejściowe, co umożliwia leukocytom toczenie się wzdłuż monowarstwy śródbłonka pod wpływem siły przepływającego pożywki.
Rolowanie pozwala leukocytom na interakcję z chemokinami, aktywując integryny i sprzyjając mocnemu zatrzymaniu leukocytów.
Następnie leukocyty rozprzestrzeniają się po monowarstwie śródbłonka, co wskazuje na ich potencjał do transmigracji, co jest kluczowym krokiem w odpowiedzi immunologicznej.
Test ten pomaga badać mechanizm adhezji, deadhezji i transmigracji leukocytów podczas perfuzji nad komórkami śródbłonka.
Użyj jednego mikromola zielonego fluorescencyjnego barwnika kwasu nukleinowego przenikającego komórkę, aby fluorescencyjnie oznaczyć leukocyty. Po znakowaniu inkubować leukocyty przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie odwiruj komórki z prędkością 300 razy g przez 5 minut, aby osadzać komórki.
Ponownie zawiesić w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami, aby przepłukać komórki. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 300 razy g przez 5 minut. W zależności od natężenia przepływu zawiesić 5 mililitrów komórek w buforze testowym. Następnie podgrzej łaźnię wodną, aby utrzymać temperaturę 37 stopni Celsjusza.
Następnie odłóż na bok 50-mililitrową strzykawkę perfuzyjną i zainstaluj ją na uchwycie strzykawki. Następnie ustaw pompę w trybie wycofania, z objętością pompy na 0 mililitrów i średnicą na 26,70 milimetra. Następnie podłącz złączkę Luer-lock do strzykawki i połącz rurkę ze złączem kolankowym luer do złącza Luer-lock. Następnie przymocuj wolny koniec rurki do komory przepływowej. Aby przylgnąć leukocyty do unieruchomionych płytek krwi, należy połączyć szkiełko ze strzykawką.
Aby perfuzji leukocytów, a następnie przylgnąć do łoża monowarstwy naczyniowej lub płytkowej, podłącz drugą rurkę do 50-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej bufor testowy, a następnie napełnij rurkę za pomocą 1-mililitrowej pipety. Po napełnieniu rurki ściśnij ją i podłącz do komory przepływowej. Przed perfuzją leukocytów dodaj 3 milimole chlorku wapnia i 2 milimole chlorku magnezu do zawiesiny komórki. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 5 minut.
Aby usunąć ewentualne powietrze, które utknęło w komorze i rurkach, przed perfuzją komórek należy przeprowadzić perfuzję z buforem testowym. Następnie ściśnij probówki, aby zamknąć koniec i przełącz rurkę z buforu testowego na zawiesinę komórki, zapobiegając w ten sposób uwięzieniu w środku pęcherzyków powietrza.
Aby dotarły pierwsze komórki, należy je przetopić z odpowiednią szybkością przepływu i naprężeniem ścinającym. Kontynuuj perfuzję komórek, utrzymując natężenie przepływu i naprężenia ścinające przez dwie minuty. Następnie uchwyć sześć obrazów toczących się i odstraszających komórek w ciągu 2 do 6 minut za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z 10-krotnym powiększeniem podłączonego do kamery cyfrowej.