JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunology
0 wyświetleń • 3:08 min. • July 8th, 2025
Zacznij od dodania nanoczujników magnetofluorescencyjnych do próbek bakteryjnych. Te nanocząstki zawierają przeciwciała specyficzne dla bakterii i barwnik fluorescencyjny.
Inkubować, aby umożliwić interakcję z bakteriami, powodując wykrywalne zmiany we właściwościach magnetycznych roztworu.
Dołącz podstawowy roztwór nanosensora bez bakterii jako kontrolę.
Przenieść każdy roztwór do relaksometru magnetycznego, w którym stałe pole magnetyczne wyrównuje cząstki magnetyczne w próbce.
Zastosuj krótki impuls, aby tymczasowo zakłócić wyrównanie.
Relaksometr mierzy, jak szybko cząstki wracają do swojego pierwotnego stanu, znanego jako czas relaksacji T2.
Nanoczujniki skupiające się wokół bakterii zwiększają T2 w porównaniu z kontrolą, umożliwiając kwantyfikację nawet przy niskich stężeniach bakterii.
I odwrotnie, wyższe stężenia bakterii zmniejszają grupowanie nanoczujników, wpływając na wartości T2.
Aby uzyskać dokładną ocenę ilościową, wykonaj pomiar fluorescencji.
W związku z tym wirować w celu wyizolowania bakterii i związanych nanoczujników.
Zawiesić osad w celu pomiaru fluorescencji.
Po wzbudzeniu fluorescencyjne nanoczujniki emitują światło, pomagając w pomiarze bakterii.
W celu przygotowania roztworów do odczytu w relaksometrii magnetycznej, najpierw pipetuje się 300 mikrolitrów PBS do probówki eppendorfa. Następnie dodaje się próbkę materiału bakteryjnego, a następnie dodaje się nanoczujniki. Roztwór jest następnie przenoszony do szklanej probówki, a na wierzchu umieszcza się kawałek parafilmu, aby zapobiec parowaniu.
Szklaną rurkę umieszcza się następnie w większej probówce NMR i wkłada do relaksometru magnetycznego. Roztwór podstawowy niezawierający bakterii, a jedynie nanoczujnik w PBS, służy do uzyskania podstawowego odczytu T2, jak pokazano. Następnie roztwory zawierające różne stężenia bakterii są wprowadzane do relaksometru magnetycznego w celu analizy, a zmiany wartości T2 są spowodowane wiązaniem między nanoczujnikami a bakteriami.
Jak pokazano, obecność zaledwie jednej bakteryjnej jtkośności można wykryć w ciągu kilku minut przy użyciu tej metody. Jednak wraz ze wzrostem stężenia bakterii odczyty MR są mniej wymierne, dlatego wykorzystanie danych dotyczących emisji fluorescencji jest również równoznaczne z dokładnym określeniem ilościowym bakterii. Zanim będzie można zebrać dane dotyczące fluorescencji, próbka musi zostać najpierw odwirowana.
Roztwór przenosi się ze szklanej probówki do probówki Eppendorfa, a następnie odwirowuje. To oddziela bakterie i związane z nimi nanoczujniki od swobodnie unoszących się nanoczujników w roztworze. Supernatant jest odrzucany, a osad bakteryjny jest ponownie zawieszany w PBS. Na koniec próbka może być analizowana za pomocą emisji fluorescencji. Siła emisji będzie zależała od ilości nanoczujników pozostających w roztworze, a zatem także od ilości obecnych bakterii.