JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunology
0 wyświetleń • 3:03 min. • July 8th, 2025
Weźmy na przykład seryjne rozcieńczenia przeciwciała skierowanego przeciwko hemaglutyniny wirusa grypy lub HA, glikoproteinie składającej się z globularnej głowy i łodygi.
Dodać rozcieńczenia do transfekowanych komórek ssaków wykazujących ekspresję związanego powierzchniowo kwasu hialuronowego. Przeciwciała wiążą się z regionami łodygi HA, tworząc kompleksy odpornościowe.
Wprowadź zmodyfikowane limfocyty T eksprymujące receptory Fc i kodujące reporter lucyferazy pod kontrolą czynnika transkrypcyjnego NFAT.
Podczas inkubacji przeciwciało związane z HA wiąże się z receptorem Fc, podczas gdy głowa HA wiąże się z kwasem sjalowym, wywołując aktywację limfocytów T i zwiększając stężenie wapnia cytozolowego.
Ta aktywacja inicjuje kaskadę sygnalizacyjną, która powoduje defosforylację NFAT, wywołując jego translokację jądrową.
NFAT wiąże się ze swoimi elementami odpowiedzi w genomie, napędzając ekspresję lucyferazy.
Dodaj przepuszczalne dla komórek podłoże bioluminescencyjne. Lucyferazy utlenia substrat, wytwarzając sygnał.
Zmniejszona luminescencja wraz ze spadkiem stężenia przeciwciał potwierdza aktywację limfocytów T za pośrednictwem przeciwciał T specyficznych dla łodygi HA.
Aby ocenić zdolność specyficznych przeciwciał będących przedmiotem zainteresowania do celowania w komórki wykazujące ekspresję hemaglutyniny, zastąp supernatant kultur komórkowych zakażonych wirusem 25 mikrolitrami pożywki testowej cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał lub ADCC.
Następnie, na oddzielnej 96-dołkowej płytce, wykonaj 4-krotne rozcieńczenie interesujących przeciwciał w potrójnym i świeżym pożywce ADCC, zaczynając od 10 mikrogramów na mililitr zgodnie ze schematem, zwracając uwagę, aby uwzględnić tło i nie kontrolować przeciwciał.
Gdy całe przeciwciało zostanie rozcieńczone, przenieść 25 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała do odpowiednich studzienek na eksperymentalnej płytce komórkowej i umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po 15 minutach dodać 7,5 razy 10 do 4. zmodyfikowanych komórek efektorowych Jurkata, wyrażając odpowiedni receptor Fc na studzienkę w 25 mikrolitrach pożywki ADCC, aby uzyskać końcową objętość 75 mikrolitrów pożywki ADCC na studzienkę.
Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na 6 godzin, rozmrażając bufor substratu lucyferazy w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza w ostatniej godzinie inkubacji. Gdy bufor jest gotowy, dodaj 75 mikrolitrów buforu substratu lucyferazy do wszystkich studzienek z wyjątkiem studzienki kontrolnej tła i odczytaj płytkę na luminometrze. Następnie można obliczyć krotną indukcję zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej w transfekowanych lub zakażonych kulturach komórkowych.