JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuroscience
0 wyświetleń • 2:41 min. • July 8th, 2025
Zacznij od hodowli embrionalnych komórek macierzystych myszy.
Umyj komórki buforem, aby usunąć media i resztki komórek.
Dodaj koktajl enzymatyczny, aby oderwać komórki od powierzchni kolby.
Dodaj pożywkę, aby zatrzymać aktywność enzymatyczną i zebrać komórki w probówce. Odwirować i odrzucić sklarowany sklarat zawierający enzymy.
Ponownie zawiesić komórki w pożywkach do hodowli neuronów wolnych od surowicy.
Wysiewaj komórki w pokrytych żelatyną studzienkach na płytki wielodołkowe.
Inkubować. Embrionalne komórki macierzyste przylegają do powierzchni pokrytej żelatyną. Składniki pożywki, w tym składniki odżywcze, czynniki wzrostu i hormony, ułatwiają proliferację komórek i tworzą monowarstwę.
Przy tej gęstości komórek embrionalne komórki macierzyste wytwarzają i uwalniają optymalne poziomy czynników wzrostu i cytokin.
Cząsteczki te uruchamiają wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe, ułatwiając różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych w progenitory nerwowe.
Wymieszaj żelatynę z 500 mililitrami ciepłego PBS i przykryj dno pojemnika na hodowlę komórkową tylko taką ilością roztworu, aby pokryć powierzchnię. Podczas powlekania żelatyny należy dwukrotnie przepłukać subkonfluentną hodowlę embrionalnych komórek macierzystych myszy w PBS. Następnie dodaj 1 mililitr odczynnika dysocjacyjnego do kultury.
Po dwóch do pięciu minutach postukaj w naczynie, aby usunąć monowarstwę do zawiesiny jednokomórkowej i zebrać kulturę w sumie 10 mililitrów pożywki i odczynnika do dysocjacji komórek.
Przenieś komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki i odwiruj je w wirówce. Następnie, po dokładnym zassaniu supernatantu, ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach wstępnie podgrzanego N2B27, pipetując o bok probówki, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.
Teraz policz komórki rejestrujące stężenie i ponownie zawieś je w odpowiedniej liczbie komórek na jednostkę objętości na studzienkę we wstępnie podgrzanym N2B27 zgodnie z tabelą. Następnie odessać żelatynę z naczynia hodowlanego i pokryć komórki płytką bez obracania pojemnika.
Umieść kultury w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, zastępując pożywkę co jeden do dwóch dni świeżym N2B27.