Budowa trójwymiarowych sieci neuronowych sprzężonych z układami mikroelektrod

Weź zawiesinę neuronów hipokampa zarodka szczura.

Przenieś neurony na obszar aktywny pokryty współczynnikiem adhezji układu mikroelektrod lub MEA. Ten obszar aktywny jest ograniczony przez strukturę polimeru.

Inkubuj MEA. Neurony przylegają do powlekanego obszaru aktywnego MEA, tworząc sieć neuronalną 2D.

Dodatkowo przenieś neurony na monowarstwę mikrokulek szklanych pokrytą współczynnikiem adhezji we wkładkach membranowych w płytce wielodołkowej.

Inkubuj, aby neurony przyczepiły się do kulek pokrytych współczynnikiem adhezji.

Przenieś mikrogranulki z przylegającymi neuronami do ograniczonego obszaru MEA zawierającego sieć neuronalną.

Mikrogranulki samoorganizują się, tworząc sześciokątną strukturę.

Powtórz transfer mikrokulek na MEA kilka razy, budując warstwy, które same się organizują, tworząc upakowaną strukturę 3D.

Dodaj pożywkę do zamkniętego obszaru aktywnego MEA i inkubuj.

Neurony rosną, tworząc połączoną sieć neuronalną 3D.

Umieść komórki w gęstości 2,000 komórek na milimetr kwadratowy w obszarze aktywnym MEA, zdefiniowanym przez ograniczenie PDMS, aby utworzyć sieć neuronalną 2D. Następnie umieść urządzenie MEA w inkubatorze z 5% nawilżoną atmosferą dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Aby zakończyć etap wstępny do budowy hodowli 3D, rozprowadź 160 mikrolitrów zawiesiny o stężeniu komórek od 600 do 700 komórek na mikrolitr na powierzchnię monowarstwy mikrogranulek umieszczonej wewnątrz płytek wielodołkowych. Następnie umieść płytki wielodołkowe w inkubatorze z 5% nawilżoną atmosferą dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Sześć do ośmiu godzin po posiewie przenieś od 30 do 40 mikrolitrów zawiesiny z mikrogranulkami i neuronami do obszaru MEA ograniczonego ograniczeniem PDMS. Po każdym przeniesieniu odczekaj około pół minuty, aby mikrogranulki mogły się samozorganizować w sześciokątną, zwartą strukturę. Gdy wszystkie warstwy zostaną osadzone i spontanicznie złożone, dodaj 300 mikrolitrów pożywki na wierzch obszaru ograniczonego ograniczeniem PDMS.

Umieść strukturę 3D sprzężoną z MEA w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 48 godzin.