JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuroscience
0 wyświetleń • 3:30 min. • July 8th, 2025
Weź nienaruszone oko myszy w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym lub aCSF i nacinaj, aby wyizolować muszlę oczną zawierającą siatkówkę.
Traktuj roztworem enzymatycznym, aby usunąć wewnętrzną błonę ograniczającą, odsłaniając komórki neuronalne.
Zanurz tkankę w roztworze hamującym, aby zatrzymać trawienie, i umyj, aby usunąć nadmiar roztworu.
Umieść tkankę w specjalistycznym inkubatorze w niskiej temperaturze, aby spowolnić metabolizm komórkowy, zachowując tkankę.
Inkubator ten składa się z głównej komory z siatką do montażu tkanek. Komora jest wypełniona płynem CSF, a jego temperatura i pH są kontrolowane w celu zachowania funkcjonalności tkanki.
Aby wyeliminować zanieczyszczenie mikrobiologiczne, aCSF jest pompowany do innej komory i poddawany działaniu promieniowania ultrafioletowego w celu zabicia wszelkich drobnoustrojów.
Wysterylizowany aCSF jest następnie pompowany z powrotem do komory głównej.
Aby wyizolować siatkówkę, zdejmij muszlę oczną, oddziel siatkówkę od otaczającej tkanki i włóż ją z powrotem do inkubatora.
W celu przygotowania całego wierzchowca siatkówki należy natychmiast wyłuszczyć oczy zwierzęcia poddanego eutanazji. Wykonaj małe nacięcie wzdłuż ora serrata i umieść oczy w pożywce Ames lub CSF z dopływem karbonu w temperaturze pokojowej. Następnie natychmiast usuń rogówkę, soczewkę i ciało szkliste, przecinając wzdłuż ora serrata małymi nożyczkami i usuń je kleszczami. Umieścić tkankę w systemie inkubacji w temperaturze pokojowej.
Aby usunąć wewnętrzną błonę ograniczającą, przenieś muszlę oczną zawierającą siatkówkę do małego szklanego słoika zawierającego papainę, L-cysteinę, EDTA i DNAzę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Nałóż karbogen na roztwór przez pokrywkę, ale nie bąbelkuj. Zatrzymaj trawienie enzymatyczne, umieszczając tkankę w roztworze ovomukoidu i BSA na 10 minut w Earl's BSS. Następnie dokładnie umyj chusteczkę za pomocą płynu mózgowo-rdzeniowego.
Następnie przenieś tkankę do systemu inkubacji i obniż temperaturę do około 15 do 16 stopni Celsjusza. Następnie przenieś tkankę siatkówki do mikroskopu; Odizoluj siatkówkę od muszli ocznej i pokrój ją na cztery części żyletką. Jeśli wymagana jest cała siatkówka, wykonaj cztery małe nacięcia na obrzeżach siatkówki, aby mogła leżeć płasko.
Tkanka ta może być teraz przeniesiona do mikroskopu w celu elektrofizjologii lub przechowywana w Braincubatorze. Tkanka jest przechowywana w głównej komorze zawierającej sondy do pomiarów pH i temperatury. Druga komora jest odizolowana od komory głównej i jest wystawiona na działanie światła UVC o mocy 1,1 W w celu napromieniowania bakterii unoszących się w roztworze. Użyj pompy perystaltycznej do cyrkulacji CSF przez dwie komory oraz termoelektrycznej zimnej płyty Peltiera do chłodzenia lub ogrzewania głównej komory.