JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuroscience
0 wyświetleń • 3:44 min. • July 8th, 2025
Zacznij od dodania perycytów do spodu wkładki studzienki.
Przykryj wkład studzienkowy płytką hodowlaną i inkubuj.
Perycyty przyczepiają się do błony wkładu studzienki, tworząc warstwę jednokomórkową lub monowarstwę.
Weź inną płytkę hodowlaną.
Dodaj ludzkie astrocyty do studzienki w odpowiednim podłożu. Następnie inkubuj płytkę.
Astrocyty przyczepiają się do dna studni i tworzą monowarstwę.
Wyrzuć pożywkę i dodaj świeże podłoże astrocytów i perycytów.
Teraz weź płytkę hodowlaną zawierającą wkładkę studzienkową z warstwą perycytów.
Odwróć płytkę i przenieś wkładkę studzienki do studzienki zawierającej warstwę astrocytów.
Dodaj komórki śródbłonka ludzkiego mózgu do górnej części wkładki studzienki i inkubuj.
Komórki śródbłonka przyczepiają się do wkładki studzienki, tworząc potrójny system hodowli komórek, który przypomina barierę krew-mózg, kluczowy interfejs oddzielający krwiobieg od mózgu.
Rozpocznij od hodowli HBVP w kolbach hodowlanych T75 z aktywowaną powierzchnią do adhezji komórek w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza aż do konfluacji. Po osiągnięciu konfluencji odessać starą pożywkę pasożyta i umyć komórki 5 mililitrami ciepłego PBS firmy Dulbecco. Odessać PBS Dulbecco i odłączyć komórki od kolby, używając kombinacji 4 mililitrów ciepłego roztworu trypsyny-EDTA i 1 mililitra PBS Dulbecco.
Inkubować kolbę przez 5 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z dwutlenkiem węgla. Obejrzeć pod mikroskopem, aby potwierdzić, czy komórki są odłączone od kolby. Dodać 5 mililitrów ciepłej pożywki pasożytniczej, zawierającej 2% FBS do kolby i przenieść oderwane komórki do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Odwirować zawiesinę komórek przez trzy minuty w temperaturze 200 g, pozwalając komórkom uformować osad na dnie probówki.
Odessać pożywkę z probówki, upewniając się, że osad komórek pozostaje nienaruszony. Zawiesić osad komórkowy w pożywce dla pasożytów. Oblicz ilość pożywki w zależności od zbiegu komórek i liczby potrzebnych wkładek studzienek. Weź 10 mikrolitrów zawieszonych komórek. Umieść je na slajdzie do liczenia komórek i policz liczbę komórek.
Określ gęstość komórek i rozsiej 300 000 komórek na wkładkę w 1 mililitrze pożywki pasożytniczej po stronie luminalnej wkładek studzienek. Hoduj pierwotne astrocyty ludzkie przy użyciu pożywki astrocytów, zawierającej 2% FBS, zgodnie z opisem w rękopisie tekstu. Określ gęstość komórek i wysiewaj 300 000 komórek na studzienkę na dnie 6-dołkowych płytek do hodowli tkankowych. Przykryj płytkę, aby zapobiec parowaniu, i inkubuj przez noc.
Wyjąć z inkubatora 6-dołkowe płytki do hodowli tkankowej zawierające astrocyty we wkładkach studzienkowych zawierających perycyty. Odessać pożywkę astrocytów z 6-dołkowych płytek do hodowli tkankowych i dodać 1 mililitr pożywki pasożytniczej i 1 mililitr pożywki astrocytowej do każdej studzienki.
Odessać pożywkę perycytową z wkładek studzienek i umieścić je w 6-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych zawierających astrocyty z nasionami. Wysiewaj HBMEC o gęstości 300 000 komórek na studzienkę w 2 mililitrach kompletnego klasycznego podłoża na wierzchołkową stronę tych samych wkładek studzienkowych.