JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuroscience
0 wyświetleń • 2:57 min. • July 8th, 2025
Weźmy urządzenie mikroprzepływowe pokryte syntetycznym polimerem i białkiem adhezyjnym.
Urządzenie składa się ze studzienek i połączonych ze sobą komór hodowlanych oddzielonych mikrorowkami.
W komorach znajdują się wybite otwory do umieszczania tkanek.
Uzyskaj zwoje nerwu trójdzielnego, zbiór ciał komórek neuronu trójdzielnego i zarodki zębów, struktury prenatalne, które rozwijają się w zęby dorosłe, z zarodka myszy.
Umieść tkanki w otworach i dodaj odpowiednią pożywkę hodowlaną.
Składniki odżywcze i witaminy zawarte w pożywce zarodkowej zęba ułatwiają przetrwanie zarazków zębów podczas hodowli.
Powlekana powierzchnia urządzenia i czynniki wzrostu w ośrodku zwojów nerwu trójdzielnego ułatwiają wzrost neurytów i aksonów.
Aksony docierają do komory zarodkowej zęba przez mikrorowki.
Sygnały pochodzące z zębów prowadzą do odpychania neuronów, umożliwiając aksonom otoczenie zarodka zęba bez jego unerwiania.
Umyj komory hodowlane buforem i utrwalij tkanki utrwalaczem.
Kokultura jest teraz gotowa do dalszej analizy.
Po rozwarstwieniu zwojów nerwu trójdzielnego i zarodków zębów usuń lamininę z urządzeń mikroprzepływowych i napełnij komory 200 mikrolitrami odpowiednich mediów. Za pomocą kleszczy delikatnie przenieś wypreparowane zwoje nerwu trójdzielnego i zarodki zębów do otworów utworzonych za pomocą stempla biopsyjnego. Upewnij się, że zarodki zębów nie unoszą się na wodzie i toną, dopóki nie zetkną się ze szkiełkami nakrywkowymi.
Hoduj próbki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Zmieniaj pożywkę co 48 godzin przez 10 dni. Aby zmienić pożywkę, najpierw usuń pożywkę, kierując pipetę w stronę zewnętrznej strony studzienek. Następnie dodaj świeże, wstępnie podgrzane podłoże po stronie studzienek znajdujących się naprzeciwko komór.
W okresie hodowli należy w dowolnym momencie obrazować współkultury za pomocą mikroskopii świetlnej. Po okresie hodowli umyj komory, pipetując 150 mikrolitrów PBS do jednej studzienki na komorę i pozwalając PBS przepływać przez komory. Powtórz pranie w sumie trzy razy.
Po ostatnim płukaniu usunąć PBS i utrwalić próbki, pipetując 150 mikrolitrów 4% paraformaldehydu w PBS do jednej studzienki na komorę i pozwalając mu przepłynąć do drugiej komory. Inkubuj urządzenie w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie dwukrotnie umyj komory PBS i przystąp do dalszej analizy, takiej jak barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie wyrostka.