JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuroscience
0 wyświetleń • 2:18 min. • July 8th, 2025
Zacznij od płytki wielodołkowej zawierającej przylegające ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste ze zdolnością różnicowania wieloliniowego.
Wprowadzić pożywkę z komórek macierzystych zawierającą dimetylosulfotlenek lub DMSO.
DMSO dostaje się do komórek i zapobiega postępowi cyklu komórkowego od fazy Gap 1 lub G1, początkowego etapu cyklu komórkowego, do syntezy lub fazy S.
W ten sposób powstaje jednolita populacja komórek w fazie G1, zwiększając ich zdolność różnicowania.
Zastąp pożywkę bogatą w składniki odżywcze pożywką różnicującą ektodermę zawierającą inhibitory szlaków sygnałowych BMP i TGF-β.
Inhibitory te wiążą się ze specyficznymi receptorami ALK na komórkach macierzystych, blokując szlaki sygnałowe BMP i TGF-β oraz zapobiegając ich różnicowaniu się w prekursory endodermy i mezodermy.
Pozwala to na selektywne różnicowanie komórek macierzystych zatrzymanych przez G1 w ektodermalne prekursory posiadające zdolność różnicowania neuronalnego.
Regularnie wymieniaj pożywkę na świeżą pożywkę, aby utrzymać poziom składników odżywczych i czynników różnicujących, zapewniając przeżycie komórek.
Wstępnie potraktuj komórki DMSO zgodnie z opisem dla kultur 2D i przygotuj roztwory podstawowe Noggin i SP431542. Przygotuj wystarczającą ilość 10% zamiennika surowicy nokautującej lub KOSR w nokautującym DMEM na trzy do czterech dni wymiany podłoża. Przygotuj ektodermalne podłoża różnicujące, dodając Noggin i SP431542 do wstępnie podgrzanego DMEM z nokautem KOSR, jak opisano w manuskrypcie.
Po wstępnej obróbce DMSO odessać pożywkę z komórek i dodać 2 mililitry pożywki różnicującej do każdej studzienki. Pozwól komórkom inkubować przez trzy do czterech dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla, codziennie zastępując pożywkę nowymi czynnikami różnicującymi.