JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuroscience
0 wyświetleń • 3:10 min. • July 8th, 2025
Umieść mysią siatkówkę na zwilżonym sitku do komórek i maceruj okrężnymi ruchami, aby oddzielić komórki siatkówki od macierzy zewnątrzkomórkowej.
Przenieś sitko do probówki zbiorczej.
Dodaj bufor fosforanowy i roztwór surowicy do sitka, aby przepłukać i zebrać komórki.
Odwirować, aby osadzić komórki. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze fosforanowym i roztworze surowicy.
Dodaj przeciwciała blokujące, które wiążą się z receptorami Fc na komórkach, zapobiegając niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał docelowych.
Następnie dodaj fluorescencyjnie znakowane i nieznakowane przeciwciała pierwszorzędowe, które wiążą się z określonymi markerami powierzchni komórek na różnych typach komórek.
Umyć w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał.
Dodaj fluorescencyjnie znakowane przeciwciało drugorzędowe, aby związać się z nieoznakowanym przeciwciałem pierwszorzędowym.
Umyć w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał.
Wykonaj sortowanie komórek aktywowane fluorescencją lub FACS, aby uchwycić wyraźne sygnały fluorescencyjne znakowanych komórek i posortować komórki zwojowe siatkówki z różnych populacji komórek siatkówki.
Umieść do 12 siatkówek na sterylnym nylonowym sitku o grubości 70 mikronów zwilżonym PBS i FBS i delikatnie maceruj siatkówkę tylnym końcem 10-mililitrowego tłoka strzykawki, wykonując ruchy okrężne. Gdy wszystkie komórki zostaną zdysocjowane, umieść sitko nad polipropylenową probówką zbiorczą i użyj pipety P1000, aby przefiltrować komórki przez sitko do probówki zbiorczej.
Przepłucz sitko za pomocą PBS i FBS, zbierając płyn w probówce zbiorczej. Dodaj tyle PBS plus FBS, aby doprowadzić końcową objętość do 1 mililitra roztworu na siatkówkę i zbierz komórki przez odwirowanie. Następnie ponownie zawiesić osad w PBS plus FBS w stężeniu 1 mililitra pożywki na 5 siatkówk. Następnie zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania receptora FC w każdej probówce za pomocą 1 mikrolitra przeciwciała anty-mysiego CD16 / 32 na 1 x 106 komórek przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Pod koniec inkubacji blokującej dodać do komórek interesujący nas koktajl przeciwciał za pomocą delikatnego pipetowania przez 30-minutową inkubację na lodzie chronionym przed światłem. Następnie umyj komórki dwa razy w 4-mililitrowej końcowej objętości PBS i FBS. Oznacz komórki odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym przez kolejne 30 minut na lodzie chronionym przed światłem, a następnie przepłucz 2 płuczki w PBS i FBS i załaduj probówkę z próbką do cytometru przepływowego.