JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuroscience
0 wyświetleń • 3:54 min. • July 8th, 2025
Umieścić szkiełko nakrywkowe zawierające embrionalne komórki nerki wykazujące ekspresję zależnych od światła kanałów jonowych i fluorescencyjne białko reporterowe w komorze pomiarowej z dodatkiem krzemu. Zamknij go i dodaj bufor zewnętrzny.
Umieść tę komorę pod mikroskopem. Umieść elektrodę do kąpieli wypełnioną agarem. Perfuzja z buforem w celu usunięcia resztek pożywki i martwych komórek.
Za pomocą filtra fluorescencyjnego zidentyfikuj komórkę docelową i skup się na niej.
Podłącz pipetę z plastrem do mikromanipulatora. Zastosuj nacisk, aby zapobiec zatkaniu i zbliż się do komórki.
Umieść pipetę w pobliżu kuwety i uwolnij nadciśnienie, aby utworzyć łatkę membrany na końcówce.
Po uformowaniu łaty membrany zastosuj podciśnienie, aby rozerwać membranę.
Zastosuj światło o określonej długości fali, aby otworzyć kanały jonowe. Ruch jonów jest rejestrowany jako zmiana napięcia przez elektrodę.
Na początek uszczelnij komorę pomiarową silikonem, aby zapobiec wyciekowi zewnętrznego bufora. Następnie umieść jedno szkiełko nakrywkowe w komorze i zamknij ją. Ostrożnie napełnij komorę buforem zewnątrzkomórkowym, aby zapobiec oderwaniu się komórek. Następnie umieść komorę pomiarową pod mikroskopem za pomocą obiektywu 40x do wizualizacji komórek.
Następnie umieść mostek agarowy na elektrodzie kąpieli i umieść go w komorze razem z czujnikiem poziomu płynu i wylotem perfuzyjnym manipulatora kąpieli. Roztwór zewnątrzkomórkowy należy wymienić dwukrotnie na 1 mililitr świeżego roztworu zewnętrznego, aby usunąć pozostałą pożywkę hodowlaną i oderwane komórki. Ustaw ostrość komórek i poszukaj transfekowanej komórki, którą należy odizolować od innych komórek. Następnie użyj trójpasmowego zestawu filtrów i pomarańczowego światła, aby wzbudzić i zobrazować mCherry.
Zamontuj pipetę na uchwycie pipety i zastosuj pewne nadciśnienie, aby zapobiec zatkaniu końcówki. Umieść końcówkę pipety do plastrów pod mikroskopem i przesuń ją w pobliże celi za pomocą mikromanipulatora.
W oprogramowaniu do akwizycji danych uruchom test membrany w trybie kąpieli i zastosuj krok napięcia. Sprawdź, czy rezystancja pipety mieści się w żądanym zakresie od 1,3 do 3,0 megaomów. Następnie wyzeruj prądy przesunięcia i wyreguluj potencjał pipety, obracając pokrętło przesunięcia pipety na amplifier.
Aby utworzyć plaster w konfiguracji całej komórki, powoli podejdź do celi z pipetą z plastrem od góry i zwolnij nadciśnienie tuż przed dotknięciem celi. Skompensuj pojemność pipety, obracając pokrętło kompensacji pojemności pipety, aby uzyskać płaską odpowiedź impulsu testowego.
Przełącz test membranowy w tryb komórkowy. Następnie rozerwij łatkę bez niszczenia uszczelki, stosując krótkie impulsy podciśnienia lub podciśnienia o rosnącej sile, aby uzyskać konformację całej komórki.
Rozpocznij kompensację rezystancji szeregowej, ustawiając dwa parametry całego ogniwa, pojemność ogniwa i rezystancję szeregową. Rejestruj prądy indukowane światłem o różnych potencjałach utrzymywania. Rysunek ten pokazuje, że podczas świecenia zielonym światłem, PSACR1 charakteryzuje się szybkim prądem przejściowym, który szybko zanika do stacjonarnego poziomu prądu.