Hamowanie aktywności neuronalnej i jej wykrywanie za pomocą elektrofizjologii u szczura

Zacznij od znieczulonego szczura zabezpieczonego w stereotaktycznej ramie z odsłoniętą czaszką.

Korzystając z anatomicznych punktów orientacyjnych, bregmy i lambdy, zlokalizuj górny wzgórek, głęboką strukturę mózgu odpowiedzialną za przetwarzanie informacji wizualnych.

Wywierć, aby utworzyć płat kostny, usuń go i nałóż bufor, aby utrzymać nawodnienie odsłoniętego mózgu.

Umieścić zespół wstrzykiwacza składający się z mikropipety z elektrodą przymocowaną do mikrostrzykawki.

Mikropipeta zawiera roztwór neuroprzekaźnika hamującego, który hamuje pobudliwość neuronów, podczas gdy elektroda jednocześnie rejestruje aktywność neuronalną.

Opuścić iniekcję do górnego wzgórka i przykryć odsłoniętą powierzchnię stopionym agarem, aby zapobiec odwodnieniu.

Obecne światło do oka, aby stymulować neurony i wywoływać zsynchronizowane potencjały czynnościowe.

Wstrzyknij neuroprzekaźnik, który wiąże się ze swoimi receptorami i wyzwala napływ jonów chlorkowych.

Ten napływ hiperpolaryzuje potencjał błonowy, tłumiąc w ten sposób potencjały czynnościowe.

Gdy stężenie neuroprzekaźników spada z czasem, aktywność neuronów odzyskuje się.

 

Aby przygotować do nagrywania pipety iniekcyjne, najpierw pociągnij 7-centymetrową kapilarnę o średnicy zewnętrznej 1 milimetra. W przypadku pionowego modelu cop 720 lub podobnego urządzenia ustaw grzałkę na 18, a elektrozawór na jeden. Następnie, w rękawiczkach, ręcznie złamij końcówkę, aby zrobić otwór i sprawdź pod mikroskopem, czy średnica wewnętrzna wynosi od 30 do 40 mikrometrów. Zmierz to za pomocą linijki wizjera. Będzie wytwarzać stosunkowo niską impedancję od 0,3 do 0,6 megaoma.

Następnie od niestożkowego końca włóż srebrny drut do pipety o długości około 7 centymetrów i pozostaw 1 do 2 centymetrów zwisających z pipety. Zegnij ten nadmiar drutu prostopadle do kapilary. Następnie weź igłę podskórną o rozmiarze 30 i nałóż elastyczny klej z tworzywa sztucznego na trzon. Następnie powoli włóż igłę do pipety tak daleko, jak to możliwe.

Dodaj więcej kleju, aby utworzyć uszczelnienie na styku pipety i igły. Końcówką pipety skierowaną do góry pozostaw zestaw do wyschnięcia na około 12 godzin. Po znieczuleniu i umieszczeniu szczura w ramie stereotaktycznej nałóż maść okulistyczną, ogol głowę do czysta.

Po zastosowaniu znieczulenia miejscowego i potwierdzeniu planu znieczulenia chirurgicznego, przystąp do nacinania skóry głowy wzdłuż mediany za pomocą ostrza skalpela numer 10. Spowoduje to odsłonięcie szwów czołowych i strzałkowych. Następnie za pomocą szpatułki chirurgicznej zidentyfikuj odniesienia anatomiczne lambda i bregma.

Dostosuj położenie głowy tak, aby te punkty orientacyjne znajdowały się poziomo w tej samej płaszczyźnie poziomej. Następnie wyzeruj cienką, sztywną wskazówkę, taką jak szklana rurka na bregmie. Następnie dostosuj położenie rury do interesującej lokalizacji, korzystając ze współrzędnych z bregmy.

Użyj Sharpie, aby narysować kwadrat wokół obszaru docelowego do kraniotomii. Teraz, za pomocą chirurgicznego wysterylizowanego wiertła, powoli usuń kość wzdłuż śladów. Zacznij od jak najmniejszego nacisku i utrzymuj wiertło w ruchu, aby uniknąć uszkodzenia tkanki spowodowanego przez głowę w wyniku tarcia.

Gdy kość stanie się cienka, ostrożnie usuń kwadratowy przekrój pęsetą. Opona twarda nie musi być usuwana, ponieważ pręt iniekcyjny będzie w nią wnikał. Idąc dalej, utrzymuj odsłoniętą korę mózgową irygowaną płynem mózgowo-rdzeniowym. Przygotować wtrysk, najpierw napełniając strzykawkę o pojemności od 5 do 10 mikrolitrów olejem mineralnym. Następnie przygotuj interesujący Cię lek z barwnikiem w soli fizjologicznej. Tutaj 0,5% Chicago Sky Blue miesza się z 300 mikromolowymi GABA.

Teraz napełnij pipetę iniekcyjną, najpierw ładując 1-mililitrową strzykawkę przygotowanym roztworem, a następnie używając strzykawki do załadowania pipety. Podczas wyjmowania strzykawki należy lekko naciskać na tłok, aby podciśnienie nie usunęło roztworu z wstrzykiwacza. Sprawdź, czy w ewentualnych miejscach wycieków nie ulatnia się płyn. Wytrzyj nadmiar płynu i ponownie sprawdź, czy nie ma wycieków.

Teraz przymocuj mikrostrzykawkę z olejem mineralnym do wtryskiwacza. Następnie zetrzyj nadmiar roztworu gazą. Sprawdzić końcówkę wtrysku. Powinno być możliwe przepuszczenie przez niego małych kropel roztworu. W przeciwnym razie jest zablokowany lub przecieka. Teraz bezpiecznie zamontuj wtryskiwacz w układzie mikropompy. Następnie przesuń położenie iniekcji do współrzędnych docelowych i opuść elektrodę do górnego wzgórka, który można zidentyfikować poprzez rejestrację wizualnych potencjałów wywołanych.

Gdy elektroda jest opuszczona, zastosuj niewielkie nadciśnienie, stosując niską szybkość wtrysku, aby uniknąć zatkania. Przerwij wstrzykiwanie, gdy struktura zostanie osiągnięta. Po wprowadzeniu iniekcji należy przykryć odsłoniętą korę ciepłym agarem, aby zapobiec wysuszeniu.

Po ostatecznym umieszczeniu elektrody należy odczekać 30 minut, aby umożliwić ustabilizowanie się tkanki otaczającej elektrodę. Następnie wstrzyknij od 400 do 800 nanolitrów roztworu z szybkością 40 nanolitrów na minutę, aż do inaktywacji aktywności neuronalnej w wzgórku górnym. Elektroda powinna wykazywać zmniejszenie kolców podczas wstrzykiwania roztworu hamującego.