Name: Przekrój nerwu ruchowego i obrazowanie poklatkowe zachowań komórek glejowych u żywych danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Poznaj metodę obrazowania poklatkowego zachowań komórek glejowych po przekrojeniu nerwu obwodowego u larw Danio rerio. Technika ta pozwala obserwować dynamiczne procesy degeneracji i regeneracji nerwu w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Kucenas Lab za cenne dyskusje oraz Quorum Technologies, Inc. za doskonałe wsparcie techniczne. Prace były wspierane przez UVa Fund for Excellence in Science and Technology (FEST) (S.K.).

1. Przygotowanie i montaż zarodków danio pręgowanego do ablacji i obrazowania na żywo
<ol>
	<li>Przygotuj bulion z 0,8% niskotopliwej agarozy w wodzie jajecznej. Porcjować do jednorazowych probówek hodowlanych 13X 100 mm i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą potrzebne.</li>
	<li>Krzyżówka dorosłego danio pręgowanego zawierającego stabilnie zintegrowane transgeny do fluorescencyjnego znakowania neuronów ruchowych i komórek glejowych będących przedmiotem zainteresowania. Zebrać zarodki danio pręgowanego w wodzie z jajami i umieścić w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C w celu późniejszej prawidłowej oceny 3.</li>
	<li>Po około 24 godzinach od zapłodnienia (hpf) usuń wodę z jaj i dodaj 0,002% 1-fenylo2-tiomocznika (PTU) do wody jajecznej. Zwróć zarodki do inkubatora.</li>
	<li>Między 24 a 96 hpf zarodki powinny być badane przesiewowo pod kątem obecności pożądanych transgenów na fluorescencyjnym mikroskopie preparacyjnym. Umieść wybrane zarodki w świeżej wodzie z jaj PTU i wróć do inkubatora.</li>
	<li>Gdy larwy osiągną 6 dni po zapłodnieniu (dpf) (lub pożądany wiek), wyjmij je z inkubatora, wybierz kilka larw do zamontowania i przenieś je do mniejszego naczynia.</li>
	<li>Usuń wodę z naczynia i natychmiast zastąp ją około 0,02% tricanem w wodzie jajecznej PTU. Pozostawić larwy w znieczuleniu na około 5 minut.</li>
	<li>Umieść podwielokrotność 0,8% niskotopliwej agarozy w zlewce z wodą z kranu i kuchenką mikrofalową na 30 sekund lub do momentu, gdy agaroza się rozpuści. Pozostawić zlewkę do ostygnięcia, aż agaroza w probówce hodowlanej będzie letnia w dotyku (nie gorąca).</li>
	<li>Wybierz znieczuloną larwę i przenieś ją do jedno- lub wielodołkowego naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm. Usuń wodę, która została przeniesiona wraz z larwą, a następnie natychmiast przykryj larwę wystarczającą ilością ciepłej agarozy, aby wypełnić część naczynia ze szklanym dnem, ale nie tworzyć dużej kopuły.</li>
	<li>Gdy agaroza stwardnieje, użyj igły do preparowania, aby ułożyć larwę na boku na dnie naczynia, a następnie lekko przechyl larwę na plecy. W przypadku zranienia i późniejszego obrazowania konieczne jest, aby zamontowana larwa dotykała szkła na dnie naczynia. Użyj igły preparującej, aby utrzymać larwę w tej pozycji, aż agaroza zestali się, a larwa zostanie unieruchomiona.</li>
	<li>Gdy agaroza całkowicie stwardnieje, powoli wlej do naczynia odpowiednią ilość wody z tricanem (może to być ten sam tricane, który jest używany do znieczulenia), aby całkowicie pokryć agarozę i larwę.</li>
</ol>
2. Kalibracja i testowanie lasera
<ol>
	<li>Włącz wszystkie oprzyrządowanie mikroskopu konfokalnego, odpowiednie lasery diodowe do ekscytujących transgenów danio pręgowanego oraz laser barwnikowy pompowany azotem. Upewnij się, że "pusty" rozdzielacz wiązki jest na swoim miejscu, tłumik laserowy jest całkowicie otwarty, a ogniwo barwnikowe kumaryny 435 nm jest na swoim miejscu. Na komputerze otwórz oprogramowanie do przetwarzania obrazu.</li>
	<li>Przesuń obiektyw do zanurzenia w wodzie 63x 1,2NA na miejsce i nałóż niewielką kroplę medium zanurzeniowego do celów wodnych na obiektyw. Obiektyw o powiększeniu 63x pozwoli na dobrą dokładność ablacji laserowej, a zanurzenie w wodzie pozwoli na większą odległość roboczą, co jest niezbędne podczas pracy z larwami danio pręgowanego o wartości 6-7 dpf.</li>
	<li>Zaopatrz się w szkiełko podstawowe z jedną lustrzaną stroną do kalibracji lasera. Umieść szkiełko lustrzaną stroną do dołu na stoliku mikroskopu.</li>
	<li>Używając okularu przy jasnym oświetleniu, znajdź i ustaw ostrość na rysie lub wytrawieniu w lustrze. Światło w jasnym polu będzie padać na szkiełko, ale przejdzie do obiektywu tylko w miejscach, w których lustro zostało porysowane lub wytrawione, powodując, że lustro będzie wyglądało na czarne przez okular, a wytrawienia będą wyglądać jak plamy lub linie światła.</li>
	<li>View i ustaw ostrość akwafort na ekranie komputera za pomocą oprogramowania do obrazowania. Otwórz okno sterujące kalibracją lasera i ustawieniami mocy. Ustaw liczbę impulsów na "1", a płytkę tłumienia na "3" % transmisji. Liczba impulsów reprezentuje liczbę impulsów, które laser uruchomi w każdym obszarze zainteresowania (ROI), a % transmisji reprezentuje moc lasera. Upewnij się, że wybrano prawidłowe ustawienie kalibracji dla obiektywu 63x 1.2NA zanurzonego w wodzie.</li>
	<li>Wybierz narzędzie elipsy z głównego paska narzędzi i kliknij obraz na ekranie komputera, aby utworzyć pojedynczy okrągły zwrot akcji. Zrób to jeszcze 3 razy, aż na obrazie pojawią się 4 okrągłe ROI.</li>
	<li>Niektóre systemy mogą zawierać funkcję bezpieczeństwa, która nie pozwoli na wyzwolenie lasera, jeśli ścieżka światła do okularów jest otwarta. W takim przypadku należy w tym momencie ręcznie zamknąć ścieżkę światła do okularów.</li>
	<li>Odpal laser. Spowoduje to utworzenie 4 małych wytrawień punktowych, po 1 w każdym okrągłym ROI. Jeśli laser nie strzela, sprawdź, czy laser jest prawidłowo włączony i podłączony oraz że ścieżka światła do okularów jest zamknięta. Jeśli laser strzela, ale nie widać wytrawienia, sprawdź, czy "pusty" rozdzielacz wiązki jest na swoim miejscu. Jeśli wszystko jest na swoim miejscu, zwiększ moc lasera i "frap", aż wytrawienia będą widoczne. Jeśli do wytrawienia szkła konieczne jest ustawienie mocy lasera większe niż 10, może to oznaczać, że wkład z plazmą laserową wymaga wymiany.</li>
	<li>Jeśli wytrawione plamy wydają się być wyśrodkowane w wybranych ROI, kalibracja nie jest konieczna (przejdź do 2.12). Jeśli plamki nie są wyśrodkowane, należy zaktualizować ustawienie kalibracji.</li>
	<li>Aby skalibrować, kliknij przycisk Aktualizuj ustawienie kalibracji. Laser wystrzeli i pojawi się obraz zawierający pojedynczy wytrawiony punkt. Jeśli punkt się nie pojawi, anuluj kalibrację, zwiększ moc lasera i ponownie rozpocznij kalibrację.</li>
	<li>Kliknij na środku miejsca. Laser wystrzeli ponownie i pojawi się kolejny punkt. Kliknij ten punkt i powtarzaj ten proces, aż kalibracja zostanie zakończona i pojawi się 9 punktów w formie siatki. Powtórz kroki 2.6-2.9, aby sprawdzić, czy kalibracja się powiodła.</li>
	<li>Zdejmij szklane szkiełko ze stolika mikroskopu i wyczyść obiektyw. Otwórz ścieżkę światła do okularów i zastąp "pusty" rozdzielacz wiązki rozdzielaczem wiązki "100%ILL".</li>
</ol>
3. Transsekcja nerwów za pomocą ablacji laserowej i poklatkowego obrazowania konfokalnego zachowań komórek glejowych
<ol>
	<li>Usuń stolik służący do przytrzymywania szkiełka szklanego i zastąp go stolikiem odpowiednim do trzymania naczyń ze szklanym dnem o średnicy 35 mm. Kontynuuj korzystanie z obiektywu 63x 1.2NA zanurzonego w wodzie.</li>
	<li>Nałóż niewielką kroplę pożywki zanurzeniowej w wodzie na obiektyw i umieść naczynie z zamontowaną larwą na scenie. Ustabilizuj naczynie za pomocą klipsów.</li>
	<li>Za pomocą okularu i oświetlenia szerokokątnego skup larwę i zlokalizuj nerwy ruchowe. Zeskanuj nerwy w półsegmentach 10-20 i wybierz nerw ruchowy do przecięcia.</li>
	<li>Wyświetl podgląd nerwu na żywo na ekranie komputera za pomocą oprogramowania do obrazowania. Wybierz płaszczyzny Z i uzyskaj obraz aksonów i komórek glejowych nieuszkodzonego nerwu.</li>
	<li>Przygotuj ustawienia obrazowania poklatkowego w oprogramowaniu do obrazowania, aby uchwycić projekcje Z wszystkich typów komórek w odstępach 5-30 minut, w zależności od eksperymentu. Najlepiej jest stworzyć wszystkie niezbędne ustawienia dla filmu poklatkowego przed wykonaniem ablacji, aby nie było opóźnienia w rozpoczęciu filmu poklatkowego po zakończeniu urazu.</li>
	<li>Usuń rozdzielacz wiązki "100%ILL" i zastąp go "pustym". Zamknij ścieżkę światła do okularów.</li>
	<li>Wróć do podglądu nerwu na żywo. Użyj odpowiedniego kanału fluorescencyjnego, aby wyświetlić aksony, które zostaną przecięte.</li>
	<li>Za pomocą narzędzia elipsy utwórz cienki eliptyczny obszar ROI w obszarze, który ma zostać poddany ablacji, a następnie utwórz mniejsze ROI w wybranym regionie.</li>
	<li>W oknie sterującym ustawieniami lasera ustaw liczbę impulsów na "2", a płytkę tłumienia na "18" % transmisji. Wystrzel laser w obrębie wybranych ROI. Jeśli fluorescencja pozostanie w ROI, zwiększ moc lasera, odczekaj około 10 sekund i ponownie uruchom laser. Rób to, aż osiągniesz ustawienie, które spowoduje, że fluorescencja zniknie w ROI.</li>
	<li>Odczekaj 10 lub więcej sekund i ponownie sprawdź obszar poddany ablacji pod kątem fluorescencji. Należy pamiętać, że zwrot z inwestycji może początkowo wydawać się ablowany, podczas gdy w rzeczywistości jest wybielany fotodynamicznie. Jeśli fluorescencja powróci, zwiększ moc lasera i ponownie uruchom laser. Powtarzaj to, aż kwitnienie zniknie w ROI i nie powróci w ciągu 10 sekund. Najlepiej zacząć od mniejszej mocy lasera i zwiększyć ją do niezbędnej mocy. Niezbędna moc lasera może się różnić w zależności od indywidualnych systemów mikroskopowych, wieku barwnika kumaryny, mocowania próbki, wieku larw i grubości tkanki. Po ustaleniu idealnej mocy lasera, to ustawienie mocy może być ponownie użyte na kolejnych nerwach w tym samym eksperymencie.</li>
	<li>Po zakończeniu ablacji rozpocznij obrazowanie poklatkowe.</li>
	<li>Po zakończeniu tworzenia filmu poklatkowego użyj oprogramowania do obrazowania, aby skompilować dane i utworzyć kolorowe projekcje Z dla każdego punktu czasowego. Utwórz film QuickTime, aby jednocześnie analizować zachowanie aksonów i komórek glejowych.</li>
</ol>

<ol><li>Geuna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+3%3A+Histology+of+the+peripheral+nerve+and+changes+occurring+during+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 27-46 (2009).</li>
<li>Hirata, K., Kawabuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+phagocytosis+by+macrophages+and+nonmacrophages+during+Wallerian+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Myelin phagocytosis by macrophages and nonmacrophages during Wallerian degeneration.</a> Microsc. Res. Tech. 57, 541-547 (2002).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+Embryonic+Development+of+the+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of Embryonic Development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Martin, S. M., O'Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wallerian+degeneration+of+zebrafish+trigeminal+axons+in+the+skin+is+required+for+regeneration+and+developmental+pruning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning.</a> Development. 137, 3985-3994 (2010).</li>
<li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), e1129(2009).</li>
<li>Parrinello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphB+signaling+directs+peripheral+nerve+regeneration+through+Sox2-dependent+Schwann+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting.</a> Cell. 143, 145-155 (2010).</li>
<li>Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+nerve-macrophage+interactions+following+peripheral+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury.</a> J. Neurosci. 32, 3898-3909 (2012).</li>
<li>Stoll, G., Muller, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+injury%2C+axonal+degeneration+and+neural+regeneration%3A+basic+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights.</a> Brain Pathol. 9, 313-325 (1999).</li>
<li>Villegas, R., Martin, S. M., O'Donnell, K., Carrillo, S., Sagasti, A., Allende, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+degeneration+and+regeneration+in+developing+zebrafish+peripheral+axons+reveals+a+requirement+for+extrinsic+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types.</a> Neural Development. 7, 19(2012).</li>
<li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+on+the+section+of+the+glossopharyngeal+and+hypoglossal+nerves+of+the+frog%2C+and+observations+of+the+alterations+pro-+duced+thereby+in+the+structure+of+their+primitive+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond%22%5BJournal%5D)">Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations pro- duced thereby in the structure of their primitive fibres.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. , 423-429 (1849).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Najważniejszymi etapami tego eksperymentalnego projektu są: 1) prawidłowe zamontowanie larw w celu urazu i późniejsze obrazowanie in vivo oraz 2) kalibracja lasera i wybór odpowiednich ustawień mocy w celu stworzenia czystej transsekcji nerwu, która skutkuje minimalnym uszkodzeniem tkanek pozatkankowych. Aby zapewnić pomyślną aksotomię do obrazowania in vivo i późniejszej analizy, należy umieścić wiele larw w pojedynczych naczyniach ze szklanym dnem lub w naczyniu ze szklanym dnem z przegrodami. Po kal...

Danio pręgowany był szeroko wykorzystywany do badania rozwoju układu nerwowego ze względu na ich przezroczystość optyczną i łatwość transgenezy, które po sprzężeniu pozwalają na spektakularne obrazowanie dynamicznych zachowań komórek w żywym embrionie. Ponadto, ponieważ danio pręgowany i ssaki mają prawie wszystkie geny potrzebne do tworzenia układu nerwowego, informacje komórkowe i molekularne zebrane w tym organizmie modelowym są bezpośrednio powiązane z innymi gatunkami kręgowców. Chociaż danio pręgowany i jego unikalne atrybuty mają ogromny potencjał w badaniach nad rozwojem neuronalnym, mogą również wyjaśnić mechanizmy, które utrzymują i odbudowują układ nerwowy po urazie. Larwy danio pręgowanego zachowują przezroczystość w późnych stadiach larwalnych, a pigmentacja może być skutecznie zablokowana za pomocą farmakologicznych inhibitorów produkcji melaniny lub mutantów genetycznych, które nie mają komórek barwnikowych. Tak więc wykorzystanie tego organizmu modelowego do badania urazów i regeneracji u starszych zwierząt jest możliwe i daje wyjątkową możliwość bezpośredniego zbadania mechanizmów komórkowych i molekularnych, które odbudowują układ nerwowy. W tym manuskrypcie opisujemy, jak skutecznie i powtarzalnie uszkadzać nerwy w PNS larw danio pręgowanego. Ten paradygmat uszkodzeń nadaje się do badania nie tylko zwyrodnienia, ale także reakcji obwodowych komórek glejowych i odpornościowych, a także interakcji między tymi populacjami podczas regeneracji.
PNS to złożona sieć nerwów motorycznych i czuciowych, która jest niezbędna do przekazywania informacji między ośrodkowym układem nerwowym (OUN) a skórą, organami i mięśniami ciała, umożliwiając organizmowi interakcję z otoczeniem i przetrwanie. Wzdłuż tych nerwów glej obwodowy, w tym mielinizujące i niemielinizujące się komórki Schwanna oraz glej okołonerwowy, a także tkanka łączna, otaczają aksony i ostatecznie tworzą dojrzały nerw. Uszkodzenie tych nerwów inicjuje proces znany jako zwyrodnienie Wallera 10. Ten mechanizm fragmentacji aksonów, rekrutacji immunologicznej, usuwania zanieczyszczeń i regeneracji jest bardzo stereotypowy i regulowany genetycznie 1. Wcześniejsze badania w układach ssaków opisywały rolę komórek Schwanna podczas degeneracji i regeneracji nerwów 1, 2, 6, 8. W tych badaniach nad utrwalonymi tkankami lub hodowlami komórkowymi komórki Schwanna nie tylko rekrutowały makrofagi do miejsca urazu, aby pomóc w usuwaniu zanieczyszczeń, ale także same pomagały w fagocytozie mielinowej. Chociaż badania te były niezwykle pouczające, nigdy wcześniej nie wizualizowaliśmy reakcji glejowych na uszkodzenie aksonów obwodowych in vivo w czasie rzeczywistym i żadne inne badania nie badały związku między różnymi klasami gleju obwodowego podczas tych zdarzeń.
Ostatnio kilka laboratoriów badało zwyrodnienie Walleriana za pomocą danio pręgowanego i laserowego uszkodzenia aksonów, podobne do tego, co opisujemy tutaj 4, 5, 7, 9. W niektórych z tych badań powierzchowne aksony czuciowe zostały poddane akskotomii u młodych larw za pomocą specjalnie zbudowanego, dwufotonowego mikroskopu konfokalnego 4, 5, 9. W innym badaniu, które jest bardzo podobne do naszego, głębsze aksony w obrębie brzusznego nerwu ruchowego zostały przecięte u 5-dniowych larw za pomocą dostępnego na rynku systemu ablacji laserowej 7. W obu tych konfiguracjach eksperymentalnych skupiono się na zwyrodnieniu Wallera i zobrazowano zarówno aksony, jak i komórki odpornościowe. Aby rozszerzyć te badania, opisujemy uszkadzanie aksonów ruchowych u starszych larw z bardziej dojrzałymi, mielinizowanymi nerwami i badamy reakcję wszystkich obwodowych komórek glejowych związanych z nerwami podczas zwyrodnienia i regeneracji.
Aby to zrobić, przeprowadzamy transekt nerwów ruchowych u larw 6 i 7 dni po zapłodnieniu (dpf) i wizualizujemy reakcje poszczególnych populacji glejowych, a także badamy interakcje między tymi populacjami wzdłuż uszkodzonych aksonów. Używając podwójnych i potrójnych linii transgenicznych, które znakują glej obwodowy, w tym komórki Schwanna i glej okołonerwowy, a także marker aksonów, używamy dostępnego na rynku systemu ablacji laserowej składającego się z pompowanego azotem lasera barwnikowego (długość fali 435 nm) podłączonego do systemu konfokalnego z wirującym dyskiem w celu utworzenia transsekcji aksonów. Ten eksperymentalny zestaw pozwala nam na wizualizację żywych, larwalnych danio pręgowanego, uszkodzenia określonych obwodowych dróg aksonów ruchowych i zobrazowanie poklatkowe reakcji różnych populacji glejowych na uszkodzenie aksonów i ich wzajemnych relacji. Protokół ten może być dalej dostosowywany do tworzenia uszkodzeń nerwów u ryb zebry w różnym wieku, z różnymi liniami transgenicznymi lub mutantami genetycznymi, aby odpowiedzieć na różne pytania naukowe.

<table><tbody><tr><td>Phenylthiourea</td><td>Sigma</td><td>P7629-100G</td><td></td></tr><tr><td>Finquel Trikaine Metanosulfonian MS-222</td><td>Argent Chemical</td><td>C-FINQ-UE-100G</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Sigma</td><td>A9414-10G</td><td></td></tr><tr><td>Quad CELLview Naczynia do hodowli komórkowych, szklane dno, sterylne, Greiner Bio One</td><td>VWR/Greiner</td><td>89125-444</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego ze szklanym dnem z pojedynczą studzienką 35 x 10 mm, grubość 12 mm</td><td>Willco Wells</td><td><a href="http://www.willcowells.com/en/products/willco-dish-glass-bottom-dishes/gwst-3512/" target="_blank">GWSt-3512</a></td><td></td></tr><tr><td>MicroPoint Laser System ze wszystkimi komponentami</td><td>Andor Technology - zakupiony przez Quorum Technologies, Inc.</td><td>2203-SYS Mikropunktowy</td><td></td></tr><tr><td>laserowy barwnik Courmarin (435 nm)</td><td>Andor Technology</td><td>MP-27-435-DYE</td><td></td></tr></tbody></table>

przekrój nerwu ruchowego i obrazowanie poklatkowe zachowań komórek glejowych u żywych danio pręgowanego

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Układ nerwowy jest często opisywany jako nierozerwalnie związany z nim składnik ciała, mimo że jest to bardzo płynny układ narządów, który reaguje na bodźce zewnętrzne w konsekwentny, stereotypowy sposób, zachowując przy tym niesamowitą elastyczność i plastyczność. W przeciwieństwie do ośrodkowego układu nerwowego (OUN), obwodowy układ nerwowy (PNS) jest zdolny do znacznej naprawy, ale dopiero zaczęliśmy rozumieć mechanizmy komórkowe i molekularne, które rządzą tym zjawiskiem. Wykorzystując danio pręgowanego jako system modelowy, mamy bezprecedensową okazję do połączenia badań regeneracyjnych z obrazowaniem in vivo i manipulacją genetyczną. Nerwy obwodowe składają się z aksonów otoczonych warstwami gleju i tkanki łącznej. Aksony są otoczone mielinizującymi lub niemielinizującymi komórkami Schwanna, które z kolei są owinięte w pęczek przez osłonkę komórkową zwaną kroczem. Po urazie dorosłe nerwy obwodowe mają niezwykłą zdolność do usuwania uszkodzonych szczątków aksonalnych i ponownego unerwiania celów. Aby zbadać rolę wszystkich obwodowych komórek glejowych w regeneracji PNS, opisujemy tutaj test przecięcia aksonów, który wykorzystuje dostępny na rynku laser barwnikowy pompowany azotem do akskotomii nerwów ruchowych u żywego transgenicznego danio pręgowanego. Dalej opisujemy metody łączenia tych eksperymentów z obrazowaniem poklatkowym uszkodzonych i kontrolnych nerwów. Ten eksperymentalny paradygmat może być wykorzystany nie tylko do oceny roli, jaką glej odgrywa w regeneracji nerwów, ale może być również platformą do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych rządzących naprawą układu nerwowego.

Opisany tutaj test może być wykorzystany do oceny odpowiedzi komórek glejowych i innych populacji komórek związanych z nerwami na uszkodzenie aksonalne in vivo. Film 1 przedstawia przykład uszkodzenia nerwu wywołanego tą metodą oraz odpowiedź otaczających komórek glejowych. Eksperyment przeprowadzono na daniowatkach zebrafish Tg(nkx2.2a:megfp);Tg(olig2:dsred), w których glej perineuralny wykazuje ekspresję EGFP skierowanego do błony komórkowej, a motoneurony wykazują ekspresję cytozolow...

Chociaż obwodowy układ nerwowy (PNS) jest zdolny do znacznej naprawy po urazie, niewiele wiadomo o komórkowych i molekularnych mechanizmach rządzących tym zjawiskiem. Korzystając z żywego, transgenicznego danio pręgowanego i powtarzalnego testu przecięcia nerwów, możemy badać dynamiczne zachowania komórek glejowych podczas degeneracji i regeneracji nerwów.

Przekrój nerwu ruchowego i obrazowanie poklatkowe zachowań komórek glejowych u żywych danio pręgowanego

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Ogólnym celem tej procedury jest obrazowanie w trybie time-lapse zachowania komórek glejowych po uszkodzeniu nerwów obwodowych u żywych larw zebrafish. Osiąga się to poprzez najpierw zamocowanie znieczulonych larw zebrafish w agarozie o niskiej temperaturze topnienia na szalkach Petriego z dna szklanego i ustawienie ich za pomocą igły sekcyjnej. Następnie zamocowane larwy umieszcza się w mikroskopie konfokalnym.Wybrano nerw do ablacji i wykonano obraz aksonów oraz komórek glejowych nieuszkodzonego nerwu. Następnie wzdłuż nerwu wyznaczono obszary zainteresowania (ROI) i wykonano impuls laserowy w celu ablacji wybranych obszarów, co doprowadziło do przerwania ciągłości nerwu. Na koniec przeprowadzono obrazowanie time-lapse aksonów i komórek glejowych po przecięciu nerwu.W rezultacie, dzięki zastosowaniu konfokalnej mikroskopii poklatkowej, można uzyskać wyniki obrazujące dynamiczne zachowanie komórek glejowych podczas degeneracji i regeneracji nerwów. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu regeneracji i biologii komórek glejowych, takie jak: w jaki sposób komórki glejowe reagują na uszkodzenie nerwu oraz w jaki sposób poszczególne podtypy gleju koordynują swoje zachowanie podczas procesów degeneracji i regeneracji?Po skrzyżowaniu dorosłych danio pręgowanych zawierających transgeny fluorescencyjnie znakujące interesujące neurony ruchowe i typy komórek glejowych oraz inkubacji embrionów do 24 godziny po zapłodnieniu (HPF), należy usunąć wodę z jaj i zastąpić ją wodą z jaj z dodatkiem 1 pH tooth threa lub PTU przed powrotem embrionów do inkubatora. Od tego momentu aż do około 96 HPF należy używać fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego w celu przesiewania embrionów pod kątem obecności pożądanego genu fluorescencyjnego. Embriony pozytywne należy przenieść do świeżej wody z jaj z PTU i zwrócić do inkubatora.Gdy larwy osiągną szósty dzień po zapłodnieniu (DPF), należy wybrać kilka embrionów do montowania i przenieść je do mniejszego naczynia. Usunąć wodę z naczynia i natychmiast zastąpić ją wodą do jaj z 0,02% tricain i PTU, a następnie inkubować larwy w środku znieczulającym przez około pięć minut. Umieścić porcję 0,8% nisko topiącego się agarozy, przygotowanej wcześniej zgodnie z protokołem tekstowym, w zlewce z wodą z kranu i włożyć do kuchenki mikrofalowej.Przez 30 sekund lub do momentu rozpuszczenia agrosu, pozostaw zlewkę do ostygnięcia, aż probówka z agrosem stanie się letnia w dotyku. Następnie przenieś znieczuloną larwę do szalki z przeszklonym dnem o średnicy 35 mm. Usuń z szalki całą wodę.Następnie natychmiast przykryj larwy odpowiednią ilością ciepłego agarosu, aby wypełnić szklaną część dna naczynia. W miarę twardnienia agarosu, za pomocą igły sekcyjnej ustaw larwy bokiem. Następnie delikatnie przechyl je na grzbiet, upewniając się, że zamocowane larwy dotykają szkła na dnie naczynia, co jest niezbędne do naniesienia urazu i obrazowania.Użyj igły, aby utrzymać larwy w pozycji do momentu stężenia agaru i unieruchomienia larwy. Następnie powoli pipetuj do naczynia odpowiednią ilość wody trica, aby całkowicie przykryć agar i larwy. Włącz całą aparaturę mikroskopu konfokalnego, odpowiednie lasery diodowe do wzbudzania transgenów rybek zebrafish oraz laser barwnikowy pompowany azotem.Upewnij się, że pusty dzielnik wiązki jest zamontowany, a koer i kuweta z barwnikiem 435 nanometr są na miejscu. W pełni otwórz atenuator lasera, a następnie uruchom oprogramowanie do obrazowania, korzystając z obiektywu imersyjnego w wodzie 63 x 1,2 na oraz szkiełka przedmiotowego z jedną stroną lustrzaną. Użyj oświetlenia w polu jasnym, aby zlokalizować i ustawić ostrość na rysie lub nacięciu w lustrze.Używając oprogramowania do obrazowania, wyświetl i ustaw ostrość trawienia na ekranie komputera w oknie sterującym kalibracją lasera i ustawieniami mocy. W głównym pasku narzędzi ustaw liczbę impulsów na jeden, a tłumienie na 3% transmission. Wybierz narzędzie elipsy i kliknij obraz na ekranie komputera.Aby utworzyć pojedynczy okrągły obszar zainteresowania (ROI), powtórz ten proces jeszcze trzy razy, aż na obrazie znajdą się cztery okrągłe obszary ROI rozmieszczone losowo. Następnie uruchom laser. Jeśli laser działa i jest odpowiednio skalibrowany, spowoduje to powstanie czterech małych wytrawionych punktów, po jednym w każdym okrągłym obszarze ROI. Następnie wyjmij szkiełko przedmiotowe ze stolika mikroskopu i wyczyść obiektyw.Zastąp pusty dzielnik wiązki dzielnikiem wiązki 100%ILL, aby przeprowadzić ablację laserową nerwu ruchowego. Nanieś niewielką kroplę medium imersyjnego do wody na obiektyw, a następnie umieść szalkę z zamontowaną larwą na odpowiednim stoliku, stabilizując ją za pomocą klipsów, korzystając z okularu i oświetlenia szerokopolowego. Ustaw ostrość na larwy i zlokalizuj neurony ruchowe.Przeskanuj nerwy w hemi-segmentach od 10 do 20 i wybierz nerw ruchowy do przecięcia. Następnie wyświetl podgląd na żywo wybranego nerwu na ekranie komputera. Wybierz płaszczyzny Z i uzyskaj obraz aksonów oraz komórek glejowych nieuszkodzonego nerwu.Następnie należy przygotować ustawienia obrazowania poklatkowego, aby rejestrować projekcje Z wszystkich typów komórek w odstępach od 5 do 30 minut. W zależności od eksperymentu należy usunąć dzielnik wiązki 100%ILL i zastąpić go pustym elementem (blank). Powróć do podglądu na żywo nerwu i użyj odpowiedniego kanału fluorescencji, aby zlokalizować aksony, które zostaną przecięte.Używając narzędzia elipsy, utwórz cienki eliptyczny obszar ROI w miejscu przeznaczonym do ablacji. Następnie utwórz mniejsze obszary ROI w obrębie wybranego regionu w oknie sterowania ustawieniami lasera. Ustaw liczbę impulsów na dwa, a płytkę tłumiącą na 18%transmission.Następnie naświetl laserem wybrane obszary ROI. Odczekaj 10 lub więcej sekund i ponownie sprawdź obszar ablacji pod kątem fluorescencji. Należy pamiętać, że obszar ROI może początkowo wydawać się zablowny, podczas gdy w rzeczywistości doszło do fotoblaknięcia, a obszary ROI mogą wymagać niewielkiej modyfikacji w trakcie ablacji, aby uzyskać całkowite przecięcie.Jeśli fluorescencja powróci, zwiększ moc lasera i wykonaj impuls. Powtarzaj tę czynność do momentu, aż fluorescencja w obrębie R OIS zniknie i nie pojawi się ponownie w ciągu 10 sekund. Po zakończeniu ablacji rozpocznij obrazowanie time-lapse; kontynuuj do momentu zakończenia serii czasowej.Użyj oprogramowania do analizy obrazowania, aby skompilować dane i utworzyć kolorowe kompozytowe projekcje Z dla każdego punktu czasowego. Utwórz film w formacie QuickTime, aby przeanalizować zachowanie aksonów i komórek glejowych jednocześnie. Opisany tutaj test może być wykorzystany do oceny odpowiedzi komórek glejowych i innych populacji komórek związanych z nerwami na uszkodzenie aksonalne in vivo.Przedstawiono tutaj przykład uszkodzenia nerwu wywołanego tą metodą oraz reakcję otaczających go komórek glejowych. Eksperyment przeprowadzono na sześciodniowych (DPF) transgenicznych rybakach zebra, które wykazywały ekspresję ukierunkowanego na błonę EGFP w gleju okołonerwowym oraz cytozolowego DS red w neuronach ruchowych. Uszkodzenie wykonano wzdłuż przedniej projekcji nerwu ruchowego tułowia, a następnie wykonano obrazowanie time-lapse w kanałach EGFP i DS red.Umożliwiło to jednoczesną wizualizację zachowań aksonów i komórek glejowych bezpośrednio po urazie. Obrazy te stanowią statyczne punkty czasowe wyodrębnione z filmu poklatkowego. Przerywana elipsa wskazuje ROI, która została ablacyjnie usunięta za pomocą lasera w pierwszej minucie.Po przekroju lub MPT obszar ablacji był pozbawiony fluorescencji, a strefa urazu mierzyła około 3,5 micrometers od kikutu proksymalnego do dystalnego. Powodzenie przekroju można potwierdzić, obrazując dystalny kikut nerwu i szukając oznak degeneracji wallerowskiej, w tym fragmentacji aksonów dystalnych i ich szybkiego usuwania. Brak fluorescencji aksonalnej wzdłuż kikutu dystalnego w 120 MPT wskazuje, że aksony te rzeczywiście uległy degeneracji wallerowskiej, a przekrój zakończył się sukcesem.Dostosowanie mocy lasera do optymalnych ustawień jest kluczowe podczas przeprowadzania eksperymentów z ablacji laserowej. Optymalne ustawienia mocy lasera pozwalają na czystą ablację nerwu wyłącznie w obrębie wybranego ROI, natomiast ustawienia mocy zbyt niskie lub zbyt wysokie przyniosą suboptymalne wyniki; przedstawiona tutaj rana powstała przy zbyt niskiej mocy lasera. Po wystrzale lasera fluorescencja pozostała w obrębie ROI, co skutkowało niepełną przekrojem.Z drugiej strony, jak pokazano na tej rycinie, zbyt wysoka moc lasera spowodowała niezwykle rozległą ablację. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać wystarczającą wiedzę na temat tego, jak montować rybki zebrafish do eksperymentów z transekcją laserową. Wykonaj transekcję za pomocą azotowego pompowanego lasera barwnikowego i oceń odpowiedź otaczających komórek, wykorzystując konfokalny obrazowanie poklatkowe.

motor-nerve-transection-time-lapse-imaging-glial-cell-behaviors-live

Research

JoVE Journal

Neuroscience

W niniejszej pracy opisujemy metodę montowania embrionów zebrafish do długotrwałego obrazowania, obrazowania dwufotonowego, technik uszkadzania tkanek oraz konfokalnego obrazowania time-lapse.

Dwufotonowa aksotomia i konfokalne obrazowanie time-lapse w żywych embrionach danio pręgowanego

Niniejszy protokół opisuje obrazowanie poszczególnych neuronów lub komórek grzebienia neuronalnego w żywych embrionach danio pruzebrzuchego. Metoda ta jest wykorzystywana do badania zachowań komórkowych oraz lokalizacji aktyny przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse.

Obrazowanie na żywo ruchliwości komórek oraz cytoszkieletu aktynowego pojedynczych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w embrionach danio pręgowanego

W tym filmie przedstawiono techniki wielokolorowego konfokalnego obrazowania time-lapse oraz celowanej ablacji komórek. Obrazowanie time-lapse jest wykorzystywane do monitorowania zachowania wielu wybranych typów komórek in vivo. Celowana ablacja komórek ułatwia badanie funkcji obwodów neuronalnych oraz paradygmatów regeneracji neuronów specyficznych dla danej grupy komórek.

Wielokolorowe obrazowanie poklatkowe transgenicznych rybek zebrafish: wizualizacja komórek macierzystych siatkówki aktywowanych przez ukierunkowaną ablację komórek neuronalnych

Źródło: Lahne, M., et.al. Hodowla dorosłych transgenicznych eksplantatów siatkówki danio pręgowanego do obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopii wielofotonowej. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje obrazowanie żywych komórek migracji jądrowej gleju Mullera w eksplantatach siatkówki danio pręgowanego osadzonych w agarozie po uszkodzeniu fotoreceptorów wywołanym światłem. Czynnik martwicy nowotworu alfa (TNF-α) uwalniany przez uszkodzone fotoreceptory aktywuje komórki glejowe Mullera,...

Obrazowanie żywych komórek migracji jądrowej gleju Mullera podczas regeneracji siatkówki danio pręgowanego

Po przecięciu kręgosłupa, dorosłe rybki pręgowane wracają do stanu funkcjonalnego w ciągu sześciu tygodni po urazie. Aby wykorzystać przezroczystość larw i szybszy powrót do zdrowia, przedstawiamy metodę transekcji rdzenia kręgowego larwy. Po przecięciu obserwujemy regenerację czuciową rozpoczynającą się po 2 dniach od urazu i ruch zgięcia C po 3 dniach od urazu.

Przekrój rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego

Regeneracja siatkówki danio pręgowanego była głównie badana przy użyciu stałych siatek oka. Jednak dynamiczne procesy, takie jak interkinetyczna migracja jądrowa, zachodzą podczas odpowiedzi regeneracyjnej i wymagają obrazowania żywych komórek w celu zbadania mechanizmów leżących u ich podstaw. W tym miejscu opisujemy warunki hodowli i obrazowania w celu monitorowania międzykinetycznej migracji jądrowej (INM) w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Hodowla dorosłych transgenicznych eksplantatów siatkówki danio pręgowanego do obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopii wielofotonowej

Tutaj prezentujemy metodę obrazowania embrionalnego mózgu danio pręgowanego in vivo, aż do stadium larwalnego i młodocianego. Ta mikroinwazyjna procedura, zaadaptowana z podejść elektrofizjologicznych, zapewnia dostęp do szczegółów komórkowych i subkomórkowych dojrzałego neuronu i może być połączona z badaniami optogenetycznymi i neurofarmakologicznymi w celu scharakteryzowania funkcji mózgu i interwencji farmakologicznej.

Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw i osobników młodocianych danio pręgowanego poprzez usunięcie czaszki i skóry

Zgłaszamy technikę pozwalającą na obrazowanie na żywo dynamiki mikrotubul w komórkach glejaka (GBM) atakujących tkankę mózgową kręgowców. Sprzężenie ortotopowego wstrzykiwania fluorescencyjnie znakowanych komórek GBM do przezroczystego mózgu danio pręgowanego z obrazowaniem przyżyciowym o wysokiej rozdzielczości umożliwia pomiar dynamiki cytoszkieletu podczas inwazji raka in situ.

Obrazowanie na żywo dynamiki mikrotubul w komórkach glejaka atakujących mózg danio pręgowanego

Pokazujemy metodę, która wykorzystuje szybką skaningową mikroskopię konfokalną do wykonywania na żywo obrazowania komórek mikrogleju w rozwijającym się tektum wzrokowym danio pręgowanego, umożliwiając analizę dynamiki tych komórek in vivo.

Obrazowanie na żywo i charakterystyka dynamiki mikrogleju w zarodku danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania aktywności neuronalnej w obszarach mózgu transgenicznego danio pręgowanego, które wyrażają wskaźniki wapnia GCaMP za pomocą mikroskopii konfokalnej.

In vivo (in vivo) Konfokalne obrazowanie fluorescencyjne aktywności neuronalnej wywołanej stymulacją sensoryczną u częściowo unieruchomionych larw danio pręgowanego

Połączenie nerwowo-mięśniowe larw danio pręgowanego jest atrakcyjnym modelem do badania fizjologii synaptycznej. Jest podatny na wiele technik eksperymentalnych, w tym elektrofizjologię i obrazowanie optyczne. W tym miejscu opisujemy protokół obrazowania transmisji synaptycznej za pomocą sondy na bazie pHluoryny pod pionowym mikroskopem epifluorescencyjnym.

Obrazowanie na żywo recyklingu pęcherzyków synaptycznych w złączu nerwowo-mięśniowym wypreparowanych larw danio pręgowanego

Poznaj metodę obrazowania poklatkowego zachowań komórek glejowych po przekrojeniu nerwu obwodowego u larw Danio rerio. Technika ta pozwala obserwować dynamiczne procesy degeneracji i regeneracji nerwu w czasie rzeczywistym.

Przekrój nerwu ruchowego i obrazowanie poklatkowe zachowań komórek glejowych u żywych danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów