Name: Zoptymalizowana metoda LC-MS/MS do wysokoprzepustowej analizy próbek klinicznych iwakaftoru, jego głównych metabolitów i lumakaftoru w płynach biologicznych pacjentów z mukowiscydozą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę HPLC-MS do analizy iwakaftoru, jego metabolitów i lumakaftoru w osoczu pacjentów z mukowiscydozą. Ta technika umożliwia niezawodne badania farmakokinetyczne leków przeciwzwyrodnieniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J.L. i T.V. są wspierane przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych (NIAID) Narodowych Instytutów Zdrowia (R01 AI111965). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych lub Narodowych Instytutów Zdrowia. MC jest australijskim głównym pracownikiem naukowym NHMRC. J. L. jest starszym pracownikiem naukowym Australijskiej Narodowej Rady ds. Zdrowia i Badań Medycznych (NHMRC), a T.V. jest australijskim pracownikiem naukowym NHMRC Industry Career Development Level 2. E.K.S został mianowany Młodym Ambasadorem 2017 przez ASM (American Society for Microbiology) i jest wspierany przez Australian Postgraduate Award. 
Część tej pracy została zaprezentowana na 12 Australijskiej Konferencji na temat Mukowiscydozy w Melbourne (5-8 sierpnia 2017 r.).

Zatwierdzenie etyki uzyskano od Komitetu Etyki Badań Naukowych Uniwersytetu Monash (MUHREC).
1. Zastosowanie testu: Pobieranie próbek od pacjentów
<ol>
	<li>Należy zanotować czas, w którym pacjent przyjmuje standardową dawkę 150 mg iwakaftoru lub iwakaftoru 125 mg / lumakaftor 200 mg.</li>
	<li>Zanotuj dokładny czas pobrania próbki krwi pacjenta. 
	UWAGA: Zalecamy pobranie 4-5 próbek w ciągu 24 godzin. Jeżeli możliwe jest pobranie tylko jednej próbki, wskazany punkt czasowy to 2,5-4 godziny po podaniu iwakaftoru lub dawki skojarzonej iwakaftoru i lumakaftoru, ponieważ stężenia Cmax w stanie stacjonarnym będą możliwe do osiągnięcia po >5 dniach kolejnego leczenia.</li>
	<li>Zbierz 4-5 ml krwi do dostępnych w handlu nieleczonych niebieskich probówek.</li>
	<li>Po pobraniu krwi pełnej pozwól krwi skrzepnąć, pozostawiając ją w spokoju w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Zwykle zajmuje to 15-30 minut.</li>
	<li>Usunąć skrzep przez odwirowanie w temperaturze 1 000-2 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w wirówce z chłodzeniem. Oznaczyć otrzymany supernatant jako osocze.</li>
	<li>Po odwirowaniu natychmiast przenieść supernatant (osocze) do czystej probówki polipropylenowej za pomocą pipety Pasteura. Oznacz probówkę osococza identyfikatorem pacjenta (np. Pacjent 1), podawanym lekiem (np. połączenie iwakaftora-lumakaftoru) oraz czasem pobrania próbki od pacjenta (np. 2,5 godziny po podaniu).</li>
	<li>Podczas obchodzenia się z próbkami należy utrzymywać temperaturę 2–8 °C. Po zakończeniu obchodzenia się z próbkami należy przechowywać je w temperaturze –20 °C.</li>
	<li>W razie potrzeby wyślij próbki zatwierdzonym kurierem do instytutu analizującego. 
	UWAGA: Próbki należy wysyłać w suchym lodzie do momentu przybycia i należy je przechowywać w temperaturze –80°C do czasu analizy.</li>
</ol>
2. Przygotowanie i przetwarzanie pobranych próbek i wzorców
UWAGA: Osocze od zdrowych dawców, którzy nigdy nie stosowali terapii iwakaftorem/lumakaftorem, uzyskano z Australijskiego Czerwonego Krzyża. Aby zapewnić integralność, wszystkie próbki/wzorce powinny być przechowywane w temperaturze 2-8 °C podczas pobierania i przetwarzania. Po zakończeniu obchodzenia się z próbkami należy przechowywać je w temperaturze –20 °C.
<ol>
	<li>Odważyć IVA, IVA-karboksylan, hydroksymetylo-IVA i LUMA, które posłużą jako odniesienie dla wzorców wewnętrznych.</li>
	<li>Przygotować dwa niezależne roztwory podstawowe każdego analitu (IVA, M1, M6 i LUMA) w metanolu klasy LC-MS w stężeniu 100 μg/ml i 10 μg/ml. 
	Uwaga: Związki tracą ważność po 10 dniach na stole.</li>
	<li>Świeżo przygotować wzorce kalibracyjne LC-MS przed każdym przebiegiem analitycznym poprzez rozcieńczenie roztworów podstawowych wzorców kalibracyjnych w osoczu ludzkim, aby osiągnąć następujące stężenia: 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 i 10,0 μg/ml. Próbki te są określane jako wzorce.</li>
	<li>Aby wytrącić białka, przygotuj 0,1% kwas mrówkowy (FA) w acetonitrylu (klasa ACN, LC-MS) i pozostaw w lodówce do czasu, aż będzie potrzebny.</li>
</ol>
3. Wstępna obróbka pobranych próbek i wzorców
<ol>
	<li>Pozwolić, aby zarówno pacjent, jak i ślepa próba osocza osiągnęły równowagę do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Wirować, aby mieszać każdą próbkę osocza przez 15 s na próbkę.</li>
	<li>Przenieść 100 μl podwielokrotności ślepej próby osocza do wzorców lub próbek pacjenta do analizy do probówki do mikropropylenu o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodaj wzorzec wewnętrzny IVA do każdej z probówek wzorcowych (np. 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 i 10,0 μg/ml, aby pokryć potencjalny zakres stężeń), zamknij pokrywkę i wiruj przez 2-3 s. Należy pamiętać, że wzorzec wewnętrzny jest dodawany tylko do ślepej próby osocza, a do próbek pacjenta nie dodaje się żadnego wzorca wewnętrznego.</li>
	<li>Powtórz krok 3.4. dla innych wzorców wewnętrznych M1, M6 i LUMA.</li>
	<li>Odkręć krótko każdą tubkę, aby upewnić się, że na pokrywie nie ma kropel.</li>
	<li>Dodać 200 μl mieszaniny 0,1% FA w ACN do każdej probówki, aby wytrącić białka osocza.</li>
	<li>Energicznie mieszaj mieszaninę przez około 15 sekund.</li>
	<li>Pozostaw probówki na 10 minut w lodówce.</li>
	<li>Wirować przy 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, jeśli to możliwe.</li>
	<li>Przefiltrować 200 μl podwielokrotności supernatantu przez 13-milimetrowy filtr strzykawkowy do fiolki o pojemności 1,5 ml do HPLC.</li>
	<li>Przenieść 100 μl supernatantu do fiolki LC-MS w celu przeprowadzenia analizy HPLC-MS.</li>
</ol>
4. Analiza HPLC-MS
UWAGA: Analiza HPLC-MS została przeprowadzona na systemie LC-MS sprzężonym z potrójnym kwadrupolowym spektrometrem masowym (Tabela 1).
<ol>
	<li>Włącz system LC-MS, umieść tackę z próbkami w automatycznym próbniku.</li>
	<li>Przymocuj kolumnę do kolumny ochronnej i podłącz do systemu LC-MS.</li>
	<li>Podłącz obie butelki z fazami ruchomymi (butelka A: 100% ACN; butelka B: 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie) i zrównoważyć system LC-MS.</li>
	<li>Włącz następujące parametry do protokołu LC-MS.
	<ol>
		<li>Podzielić przepływ fazy ruchomej przed wprowadzeniem do spektrometru mas w stosunku 2:1 (odpad: wlot MS).</li>
		<li>Przeprowadzić elucję gradientową przy natężeniu przepływu 0,5 ml/min przy użyciu fazy ruchomej składającej się ze 100% ACN i 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie (punkt początkowy 40:60, v/v). Należy zauważyć, że procent objętości fazy ruchomej zmienia się w trakcie analizy.</li>
		<li>Uruchomić spektrometr masowy w trybie dodatniej jonizacji elektronatryskowej.</li>
		<li>Upewnij się, że ustawienia LC-MS są następujące: napięcie rozpylania jonów 4,5 kV, energia zderzenia 295,9 V, gaz nebulizujący: azot o stężeniu 3 l/min; gaz zderzeniowy: argon; przepływ gazu suszącego 20 l/min, napięcie soczewki Q3: - 22 V, temperatura desolwatacji 250 °C przy temperaturze bloku grzewczego 400 °C.</li>
		<li>Wstrzyknąć 10 μl objętości na próbkę.</li>
		<li>Wykrywanie analitów za pomocą monitorowania reakcji wielokrotnych (MRM). Monitoruj przemiany jonowe m/z 392.49 → 393, m/z 408.49 → 409, m/z 422.47 → 423 i m/z 452.40 → 453 odpowiednio dla IVA, IVA-M1, IVA-M6 i LUMA. 
		UWAGA: Nowo zoptymalizowana metoda nie została jeszcze w pełni zwalidowana zgodnie ze standardami FDA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Krzywe kalibracyjne
<ol>
	<li>Skonstruuj krzywe kalibracyjne LC-MS przed każdym przebiegiem analitycznym, wykorzystując zależność między stosunkami powierzchni pików każdego z czterech analitów do wzorca wewnętrznego a nominalnymi stężeniami iwakaftora w wzorcu kalibracyjnym (IVA-M1, IVA-M6 lub LUMA) w programie ustawień LC-MS. 
	UWAGA: Dokładne kroki budowy krzywej kalibracyjnej zależą od modelu używanego sprzętu LC-MS. Informacje te mogą być dostępne w instrukcji obsługi sprzętu.</li>
	<li>Przeprowadzić liniową analizę regresji metodą najmniejszych kwadratów, ważąc 1/C2 zgodnie z odwrotnością stężeń.</li>
</ol>

<ol><li>Schneider, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-drug+plasma+protein+binding+interactions+of+ivacaftor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Recognit%22%5BJournal%5D)">Drug-drug plasma protein binding interactions of ivacaftor.</a> J Mol Recognit. 28 (6), 339-348 (2015).</li>
<li>Solomon, M., Leatte, P. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSolomon%2C+M+%22Treatments+for+Cystic+fibrosis%22">Treatments for Cystic fibrosis</a>. , (2009).</li>
<li>O'Sullivan, B. P., Flume, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+approach+to+lung+disease+in+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">The clinical approach to lung disease in patients with cystic fibrosis.</a> Semin Respir Crit Care Med. 30 (5), 505-513 (2009).</li>
<li>Ramsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CFTR+potentiator+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation.</a> N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).</li>
<li>Wainwright, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumacaftor-Ivacaftor+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis+Homozygous+for+Phe508del+CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR.</a> N Engl J Med. 373 (3), 220-231 (2015).</li>
<li>Hadida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+N-%282%2C4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl%29-4-oxo-1%2C4-dihydroquinoline-3-carboxamide+%28VX-770%2C+ivacaftor%29%2C+a+potent+and+orally+bioavailable+CFTR+potentiator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery of N-(2,4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl)-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxamide (VX-770, ivacaftor), a potent and orally bioavailable CFTR potentiator.</a> J Med Chem. 57 (23), 9776-9795 (2014).</li>
<li>FDA. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22FDA+Advisory+Commitee+Briefing+Material+VERTEX-FDA+Pulmonary-Allergy+drugs+advisory+commitee%22">FDA Advisory Commitee Briefing Material VERTEX-FDA Pulmonary-Allergy drugs advisory commitee</a>. 98 , VERTEX Pharmaceuticals Incorporated. (2015).</li>
<li>Holmes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((False+dawn+for+cystic+fibrosis+disease+modifiers%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">False dawn for cystic fibrosis disease modifiers?</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (10), 713-714 (2014).</li>
<li>Veit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+gating+potentiators%2C+including+VX-770%2C+diminish+DeltaF508-CFTR+functional+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Some gating potentiators, including VX-770, diminish DeltaF508-CFTR functional expression.</a> Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297(2014).</li>
<li>Cholon, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiator+ivacaftor+abrogates+pharmacological+correction+of+DeltaF508+CFTR+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Potentiator ivacaftor abrogates pharmacological correction of DeltaF508 CFTR in cystic fibrosis.</a> Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297(2014).</li>
<li>EMA, <a target="_blank" href="http://www.ema.europa.eu/ema/index.jsp?curl=pages/medicines/human/medicines/003954/human_med_001935.jsp&mid=WC0b01ac058001d124">Assessment report ORKAMBI (ivacaftor/lumacaftor) European medicines agency</a>. , (2015).</li>
<li>VERTEX. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Vertex+prescribing+infomation%22">Vertex prescribing infomation</a>. , (2015).</li>
<li>Matthes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+free+drug+concentration+prevents+inhibition+of+F508del+CFTR+functional+expression+by+the+potentiator+VX-770+%28ivacaftor%29%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Low free drug concentration prevents inhibition of F508del CFTR functional expression by the potentiator VX-770 (ivacaftor).</a> Br J Pharmacol. 173 (3), 459-470 (2016).</li>
<li>Schneider, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+HPLC+and+LC-MS%2FMS+methods+for+the+analysis+of+ivacaftor%2C+its+major+metabolites+and+lumacaftor+in+plasma+and+sputum+of+cystic+fibrosis+patients+treated+with+ORKAMBI+or+KALYDECO%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chrom+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Development of HPLC and LC-MS/MS methods for the analysis of ivacaftor, its major metabolites and lumacaftor in plasma and sputum of cystic fibrosis patients treated with ORKAMBI or KALYDECO.</a> J Chrom B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1038, 57-62 (2016).</li>
<li>Su, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+LC-MS%2FMS+method+for+the+quantitation+of+cabozantinib+in+rat+plasma%3A+application+to+a+pharmacokinetic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">An LC-MS/MS method for the quantitation of cabozantinib in rat plasma: application to a pharmacokinetic study.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 985, 119-123 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jak wcześniej informowaliśmy, nasza grupa po raz pierwszy opracowała i zwalidowała metodę HPLC i LC-MS do szybkiego wykrywania i oznaczania ilościowego iwakaftora i jego głównych metabolitów hydroksymetylo-IVA M1 (aktywnego) i karboksylanu IVA M6 (nieaktywnego); i lumakaftor w osoczu i plwocinie pacjentów z mukowiscydozą14. Test opisany wcześniej przez naszą grupę został z powodzeniem wykorzystany do ilościowego określenia stężenia LUMA, IVA, IVA-M1 i IVA-M6 w osoczu i plwocinie pacjentów z mukowi...

Mukowiscydoza (CF) jest powszechną chorobą genetyczną obejmującą zewnątrzwydzielnicze gruczoły śluzowe płuc, wątroby, trzustki i jelit, powodującą postępującą niewydolność wielonarządową, taką jak pogorszenie czynności płuc i niewydolność trzustki1,2,3. Ivacaftor (IVA) jest pierwszym zatwierdzonym przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA-USA) i Europejską Agencję Leków (EMA) lekiem nasilającym transbłonowy regulator przewodnictwa (CFTR) w mukowiscydozie, o udowodnionej skuteczności klinicznej powodującej znaczną poprawę czynności płuc w porównaniu z placebo w niewielkiej podgrupie pacjentów z mukowiscydozą z mutacją missense G551D-CFTR [glicyna (G) w pozycji 551 jest zastąpiona przez kwas asparaginowy (D)] (~4-5% populacji mukowiscydozy)4,5. Ten doustnie podawany lek zwiększa otwarcie kanału CFTR, zwiększając tym samym przepływ jonów chlorkowych i działając na główny defekt, który prowadzi do klinicznych objawów CF4,6. Niestety, monoterapia IVA nie jest skuteczna u pacjentów z bardziej powszechną homozygotyczną mutacją F508del [w ramkowej delecji genu CFTR, która powoduje utratę fenyloalaniny (F) w pozycji 508], co skutkuje nieprawidłowym fałdowaniem CFTR, co obserwuje się u ~50% populacji CF7,8.
Niedawno, FDA wydała zgodę na połączenie IVA z lekiem korygującym CFTR lumakaftorem. Sprytna strategia polegająca na połączeniu korektora CFTR (lumakaftor, LUMA), który ratuje F508del-CFTR na powierzchni komórki, z modulatorem (IVA), który nasila aktywność kanału CFTR, skutecznie rozszerza okno leczenia na większość populacji CF5. Pozostają pytania, czy te leki spełnią swoją obietnicę, ponieważ pojawiło się wiele sprzecznych doniesień, które poddają w wątpliwość ich skuteczność kliniczną9,10. Ponadto poprawa czynności płuc była tylko niewielka (2,6-4% dla kombinacji iwakaftora-lumakaftoru) w porównaniu z sukcesem osiągniętym po monoterapii IVA u pacjentów z mutacją G551D (10,6-12,5%)8. Potencjalne antagonistyczne interakcje lek-lek pomiędzy IVA i LUMA, które potencjalnie ograniczają skuteczność kliniczną kombinacji iwakaftor-lumakaftor, wynikają z jego nieidealnych właściwości farmakokinetycznych 7,11. IVA jest intensywnie metabolizowany przez enzymy cytochromu P450 (CYP), głównie do aktywnego metabolitu hydroksymetylo-IVA (IVA-M1, M1) i nieaktywnej formy karboksylanu IVA (IVA-M6, M6)7,12. Z drugiej strony, induktor CYP3A4 LUMA nie jest intensywnie metabolizowany i jest w dużej mierze wydalany w postaci niezmienionej w kale11. Ponieważ induktory CYP3A4 indukują metabolizm cytochromu, stężenie iwakaftoru (substratu CYP3A4) może być zmniejszone. Co więcej, zarówno IVA, jak i LUMA są cząsteczkami bardzo hydrofobowymi i są związane w ~99% z białkami osocza, co znacznie ogranicza stężenie wolnego (aktywnego) leku1,13.
Łącznie, te czynniki mogą się łączyć, aby ograniczyć kliniczną skuteczność kombinacji iwakaftora i lumakaftoru. Nie wiadomo, czy przy obecnym schemacie dawkowania iwakaftor i lumakaftor są osiągane optymalne stężenia w osoczu, czy też próg terapeutyczny jest utrzymany8. Obecnie brakuje informacji na temat parametrów farmakokinetycznych takich jak szczytowe i stacjonarne stężenie iwakaftoru lub iwakaftoru-lumakaftoru w osoczu w stanie stacjonarnym. Biorąc pod uwagę odnotowany metabolizm iwakaftoru i lumakaftoru, konieczne jest monitorowanie zależności ekspozycja-odpowiedź w celu uzyskania optymalnych schematów dawkowania iwakaftoru lub iwakaftoru i lumakaftoru. Nasza grupa opublikowała niedawno pierwszą metodę HPLC/LC-MS do monitorowania zależności ekspozycja-odpowiedź IVA i LUMA14. Dotychczas nie zgłoszono żadnych alternatywnych metod pomiaru stężeń iwakaftoru, jego metabolitów i lumakaftoru. Aby umożliwić wysokoprzepustową analizę większego zbiorowi pacjentów i radykalnie skrócić czas analizy, nasza grupa zoptymalizowała raportowaną metodę poprzez zastosowanie kolumny chromatograficznej z odwróconymi fazami o mniejszym rozmiarze porów i gradientowego systemu rozpuszczalnikowego, który zmniejsza koszty i czas pracy.

<table><tbody><tr><td>IVA (Kot#S114)&nbsp;</td><td>SelleckChem (Stany Zjednoczone).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LUMA (Kot#S1565)&nbsp;</td><td>SelleckChem (Stany Zjednoczone).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Karboksylan IVA (Cat# 510242247CS)&nbsp;</td><td>Clearsynth (Kanada).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hydroksymetylo-IVA (Kat# 510240849CS)&nbsp;</td><td>Clearsynth (Kanada).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol (klasa MeOH, LC-MS),&nbsp;</td><td>Acetonitryl Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(klasa ACN, LC-MS)&nbsp;</td>Kwas mrówkowy <td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(FA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>trzykwadrupolowy Shimadzu 8030 LC-MS&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenomenex Kinetex (2.6 &mikro; m C8 100 & Aring; 50 i razy; 2,1 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(filtr liniowy KrudKatcher Ultrea HPLC 0,5 m filtr głębokości x 0,004 cala).&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek z polipropylenu o pojemności 1,5 ml (VWR).&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5430</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>13-milimetrowy filtr strzykawkowy (0,45 &mikro; m nylon, GRACE, Stany Zjednoczone)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 &mikro; L, PTFE/przegroda silikonowa].&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zoptymalizowana metoda lc-ms/ms do wysokoprzepustowej analizy próbek klinicznych iwakaftoru, jego głównych metabolitów i lumakaftoru w płynach biologicznych pacjentów z mukowiscydozą

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Wady w błonowym regulatorze przewodnictwa (CFTR) mukowiscydozy są przyczyną mukowiscydozy (CF), choroby z zagrażającymi życiu objawami płucnymi. Kombinacja iwakaftoru (IVA) i iwakaftoru i lumakaftora (LUMA) to dwa nowe, przełomowe leki na mukowiscydozę, które bezpośrednio modulują aktywność i transport wadliwego białka CFTR. Nadal jednak brakuje wiedzy na temat parametrów farmakokinetycznych i farmakodynamicznych oraz farmakologii iwakaftoru i lumakaftoru. Technika HPLC-MS do jednoczesnej analizy stężeń iwakaftoru, hydroksymetylo-iwakaftoru, karboksylanu iwakaftora i lumakaftoru w płynach biologicznych u pacjentów otrzymujących standardową terapię iwakaftorem lub terapią skojarzoną iwakaftor-lumakaftor została wcześniej opracowana przez naszą grupę i częściowo zwalidowana zgodnie ze standardami FDA. Jednak, aby umożliwić wysokoprzepustową analizę większej liczby próbek pobranych od pacjentów, nasza grupa zoptymalizowała opisaną metodę poprzez zastosowanie kolumny chromatografii z odwróconymi fazami o mniejszej wielkości porów (2,6 μm, C8 100 A; 50 x 2,1 mm) i gradientowego systemu rozpuszczalnikowego (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2,7 min: utrzymywany na poziomie 70% B; 2,7-2,8 min: 70-90% B; 2,8-4,0 min: pranie 90% B; 4,0-4,1 min: 90-40% B; 4,1-6,0 min: utrzymywane na poziomie 40% B) zamiast elucji izokratycznej. Celem tego badania było radykalne skrócenie czasu analizy HPLC-MS na próbkę z ~15 minut do zaledwie 6 minut na próbkę, co jest niezbędne do analizy dużej liczby próbek pacjentów. Ta celowa metoda będzie bardzo przydatna w badaniach nad zależnościami między ekspozycją a reakcją tych przełomowych leków na mukowiscydołę.

Niedawno opisaliśmy metodę, częściowo zwalidowaną zgodnie ze standardami FDA, z wykorzystaniem potrójnego kwadrupolowego LC-MS oraz detektora HPLC, przy użyciu kolumny C8 (5 µm, 3,9 mm x 50 mm i.d.) z fazą ruchomą składającą się ze 100% ACN i 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie (40:60, v/v) przy szybkości przepływu 1 mL/min. Zaobserwowano liniową korelację pików w zakresie stężeń od 0,01 do 10 µg/mL w ludzkiej plazmie dla wszystkich metabolitów, ivacaftoru, Iva-M1, Iva-M6 oraz lumacaftoru14. W niniejsz...

Ivacaftor i kombinacja iwakaftoru-lumakaftora to dwa nowe leki na mukowiscydozę. Jednak nadal brakuje wiedzy na temat ich farmakokinetyki / choroby farmakologicznej i farmakologii. Przedstawiamy zoptymalizowaną technikę HPLC-MS do jednoczesnej analizy iwakaftoru i jego głównych metabolitów oraz lumakaftoru.

Zoptymalizowana metoda LC-MS/MS do wysokoprzepustowej analizy próbek klinicznych iwakaftoru, jego głównych metabolitów i lumakaftoru w płynach biologicznych pacjentów z mukowiscydozą

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Niniejszy protokół opisuje przygotowanie próbek do analizy plazmy. Należy pamiętać, że w celu zapewnienia ich integralności wszystkie próbki i wzorce powinny być przechowywane w temperaturze od 2 do 8 °C podczas pobierania i przetwarzania. Po zakończeniu obróbki wszystkie próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C.W celu przygotowania standardów, należy sporządzić dwa niezależne roztwory zapasowe każdego anilidu, ivacaftoru, metabolitu M1, metabolitu M6 oraz lumacaftoru w metanolu w stężeniach 100 µg/mL oraz 10 µg/mL. Należy pamiętać, że związki te tracą ważność po 10 dniach przechowywania w temperaturze pokojowej. Do przygotowania standardów należy przenieść 100 µL ludzkiej osocza do polipropylenowych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.Powtórz tę czynność dla wszystkich pozostałych próbek. Następnie dodaj wzorzec wewnętrzny do każdej probówki. Na przykład, wybieramy 0,01 µg/mL z przygotowanego roztworu wzorcowego.Teraz probówka zawiera plazmę wzbogaconą standardem wewnętrznym. Postęp w ten sam sposób ze wszystkimi pozostałymi standardami. Pobierz standardy i odwiruj je przez kilka sekund, aby upewnić się, że cały płyn znajduje się na dnie probówki.Powtórz tę czynność dla wszystkich 40 wzorców. W przypadku próbek pacjentów przenieś 100 µL z probówki z próbką pacjenta do probówki do mikrocentryfugi. Autentyczna próbka pacjenta nie jest wzbogacona wzorcem wewnętrznym.Wiruj próbkę pacjenta przez kilka sekund, aby upewnić się, że cały płyn znajduje się na dnie probówki. Kolejne kroki dotyczą zarówno próbek, jak i wzorców. Do każdej probówki z próbką dodaj 200 µL 0,1% kwasu mrówkowego w acetonitrylu w celu wytrącenia białek osocza.Powtórz tę czynność dla wszystkich wzorców i próbek pacjentów. Każdą próbkę intensywnie wymieszaj w wirówce vortex przez około 15 sekund. Powtórz tę czynność dla wszystkich wzorców i próbek z analizą poziomu substancji w organizmie (incurred samples).Pozostawić na 10 minut w lodówce, aby ułatwić wytrącanie. W celach demonstracyjnych odwiruję tylko jedną próbkę i jeden standard. Wirowanie przeprowadzamy z prędkością 10 000 rpm przez 10 minut w wirówce Eppendorf Centrifuge 5430 w temperaturze czterech stopni.Następnie przefiltrujemy nadsącz do fiolek Phenomenex. W tym celu używamy 13 mm filtrów strzykawkowych z nylonową membraną Grace o porach 0,45 µm zakupionych w USA i filtrujemy do fiolek HPLC o pojemności 1,5 ml. Po filtracji przeniesiemy 100 µl nadsączu do fiolek LC/MS w celu przeprowadzenia analizy LC/MS.Próbka jest teraz gotowa do analizy. Teraz wystarczy umieścić wszystkie próbki w statywie na fiolki. Używamy systemu Shimadzu 8030 LC/MS połączonego z potrójnym spektrometrem mas quadrupole.Pozostaw system do czasu osiągnięcia stanu równowagi przed przystąpieniem do analizy. Po ustabilizowaniu systemu, co zajmuje około 15 minut, naciśnij przycisk Start. Dla każdego metabolitu sporządź krzywą kalibracyjną, nanosząc stosunki powierzchni piku anilidów w funkcji nominalnego stężenia wzorców kalibracyjnych.Użyj równania regresji dla krzywej kalibracyjnej, aby obliczyć stężenia anilidów w próbce badanej. Typowy chromatogram przedstawiono na tej rycinie. Zoptymalizowaną rozdzielczość chromatograficzną uzyskano, stosując fazę ruchomą składającą się ze 100% acetonitrile i 0,1% formic acid w wodzie z elucją gradientową na kolumnie Phenomenex Kinetex C8.Czasy retencji w LC były następujące: dla M6 wynosiły one jedną minutę, a dla M1 1,3 minuty.Dla iwakaftoru czas retencji wyniósł 1,55 minuty, a dla lumakaftoru 2,3 minuty. we wszystkich blankowych próbkach osocza nie zaobserwowano zakłóceń czasu retencji żadnego z anilidów, ani nie wykryto zakłóceń wynikających z połączenia iwakaftoru z lumakaftorem.Dzięki wysokoprzepustowej analizie dużej liczby próbek pacjentów zoptymalizowaliśmy naszą opisaną metodę poprzez zastosowanie kolumny do chromatografii odwróconej Phenomenex C8 o mniejszym rozmiarze porów oraz gradientowego układu rozpuszczalników zamiast dotychczasowej elucji izokratycznej. Skraca to czas analizy do sześciu minut na próbkę, wliczając fazę płukania. Ta niezawodna i nowatorska metoda stanowi proste, czułe i szybkie podejście do monitorowania terapeutycznego poziomu leków ivacaftor oraz kombinacji ivacaftor-lumacaftor w płynach biologicznych.Z uwagi na konieczność opracowania zależności między ekspozycją a odpowiedzią w celu maksymalizacji skuteczności leku oraz ograniczenia kosztów opieki zdrowotnej, niezbędne jest opracowanie i walidacja bardziej czułych narzędzi, które pomogą klinicystom w stosowaniu terapii opartej na dowodach oraz wysokoprzepustowych technik analitycznych u pacjentów cierpiących na CF. Zastosowanie proponowanej metody analitycznej w klinicznych badaniach farmakokinetycznych i farmakodynamicznych stwarza możliwość dalszego zbadania parametrów farmakokinetycznych iwakaftoru lub kombinacji iwakaftor-lumakaftor na większej grupie pacjentów.

optimized-lc-msms-method-for-high-throughput-analysis-clinical

Research

JoVE Journal

Medicine

Profilowanie metabolitów nieukierunkowanych za pomocą ultra wydajnej chromatografii cieczowej w połączeniu ze spektrometrią mas (UPLC-MS) jest potężną techniką badania metabolizmu.  W tym artykule przedstawiono typowy przepływ pracy wykorzystywany do nieukierunkowanego profilowania metabolitów w surowicy, w tym organizację i przygotowanie próbki, pozyskiwanie danych, analizę danych, kontrolę jakości i identyfikację metabolitów.

Wielkoskalowe, nieukierunkowane profilowanie metabolomiczne surowicy za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UPLC-MS)

Tutaj opisujemy test wysokiej wydajności chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (HPLC-MS/MS) do ilościowego oznaczania immunosupresyjnego takrolimusu w wysuszonych plamach krwi przy użyciu prostego ręcznego etapu wytrącania białka i ekstrakcji kolumnowej online.

Oznaczanie ilościowe takrolimusu działającego immunosupresyjnie na wysuszonych plamkach krwi za pomocą LC-MS/MS

Kompetencja metaboliczna systemów in vitro jest kluczowym wymogiem dla biotransformacji i dystrybucji leków i substancji toksycznych. W niniejszym protokole opisano zastosowanie referencyjnych sond metabolicznych do oceny metabolizmu fazy I w hodowlach komórkowych.

Spektrometria mas i podejścia oparte na luminogenice w celu scharakteryzowania kompetencji metabolicznych fazy I kultur komórkowych in vitro

Tutaj opisujemy protokół wykorzystujący mikrodysekcję laserową w połączeniu z analizą LC/MS do przestrzennego ilościowego określania dystrybucji leków w ziarniniakach gruźlicy płuc. Podejście to ma szerokie zastosowanie w ilościowym określaniu stężeń leków w tkankach przy dużej szczegółowości przestrzennej.

Kwantyfikacja przestrzenna leków w zmianach gruźlicy płuc za pomocą mikrodysekcji laserowej Chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas (LCM-LC/MS)

Tutaj opisujemy wysokoprzepustową metodę kompleksowego nadzoru nad narkotykami, która pozwala na lepszą rozdzielczość i wykrywanie dużych paneli nadużywanych narkotyków i ich metabolitów, z kontrolą jakości opartą na wielosegmentowej elektroforezie kapilarnej i spektrometrii mas.

Wysokowydajny i kompleksowy nadzór nad lekami za pomocą wielosegmentowej elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas

Diagnostyczne filtrowanie fragmentacji, zaimplementowane w MZmine, to eleganckie, post-akwizycyjne podejście do przesiewania zbiorów danych LC-MS/MS dla całych klas zarówno znanych, jak i nieznanych produktów naturalnych. To narzędzie przeszukuje widma MS/MS pod kątem jonów produktowych i/lub strat neutralnych, które analityk zdefiniował jako diagnostyczne dla całej klasy związków.

Naturalne odkrywanie produktu z diagnostycznym filtrowaniem fragmentacji LC-MS/MS: zastosowanie do analizy mikrocystyny

Tutaj prezentujemy solidny protokół do ilościowego oznaczania 40 związków biorących udział w centralnym metabolizmie węgla i energii w reakcjach syntezy białek bez komórek. Bezkomórkowa mieszanina syntezy jest derywatyzowana aniliną w celu skutecznego rozdzielania za pomocą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami, a następnie oznaczana ilościowo za pomocą spektrometrii mas przy użyciu izotopowo znakowanych wzorców wewnętrznych.

Bezwzględna kwantyfikacja metabolizmu syntezy białek bezkomórkowych za pomocą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami i spektrometrią mas

Obecne metody analizy przestrzegania przez pacjentów złożonych schematów leczenia gruźlicy opornej na leki (DR-TB) mogą być niedokładne i wymagające dużych zasobów. Nasza metoda analizuje włosy, łatwo zbieralną i przechowywaną matrycę, pod kątem stężeń 11 leków DR-TB. Dzięki LC-MS/MS możemy określić poziomy leków poniżej nanogramów, które można wykorzystać do lepszego zrozumienia przestrzegania leków.

Zweryfikowany panel LC-MS/MS do ilościowego określenia 11 leków opornych na gruźlicę w małych próbkach włosów

Opisany tutaj jest protokół oznaczania czterech różnych metabolitów tryptofanu generowanych w szlaku kinureniny (kynurenina, 3-hydroksykinurenina, kwas ksanturonowy, kwas 3-hydroksyantranilowy) w pożywce pobranej z kultur komórek nowotworowych analizowanych za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej z pojedynczą kwadrupolową spektrometrią mas.

Jednoczesna kwantyfikacja wybranych kinurenin analizowanych metodą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas w pożywce pobranej z kultur komórek nowotworowych

Protokoły opisują metody wysokosprawnej chromatografii cieczowej w połączeniu z indeksem załamania światła lub detekcją spektrometryczną mas do badania reakcji metabolicznych w złożonych systemach bezkomórkowych opartych na lizacie.

Chromatografia cieczowa sprzężona z wykrywaniem indeksu refrakcji lub spektrometrii mas w celu profilowania metabolitów w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie

Poznaj zoptymalizowaną metodę HPLC-MS do analizy iwakaftoru, jego metabolitów i lumakaftoru w osoczu pacjentów z mukowiscydozą. Ta technika umożliwia niezawodne badania farmakokinetyczne leków przeciwzwyrodnieniowych.

Zoptymalizowana metoda LC-MS/MS do wysokoprzepustowej analizy próbek klinicznych iwakaftoru, jego głównych metabolitów i lumakaftoru w płynach biologicznych pacjentów z mukowiscydozą (Wideo) | JoVE Journal

Zoptymalizowana metoda LC-MS/MS do wysokoprzepustowej analizy próbek klinicznych iwakaftoru, jego głównych metabolitów i lumakaftoru w płynach biologicznych pacjentów z mukowiscydozą

Przeglądaj więcej filmów