Name: Wykrywanie Candidatus Liberibacter asiaticus do stosowania w terenie za pomocą amplifikacji polimerazy rekombinazy w połączeniu z CRISPR-Cas12a (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T12:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Poznaj metodę CLas-DETECTR łączącą amplifikację polimerazy rekombinazy z CRISPR-Cas12a do szybkiego wykrywania Candidatus Liberibacter asiaticus w polowych warunkach. Ta technika umożliwia diagnostykę Huanglongbing w cytrusach w ciągu 90 minut.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była finansowana przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2021YFD1400805), Główny Program Badawczo-Rozwojowy Nauki i Technologii Prowincji Jiangxi (20194ABC28007), Projekty Departamentu Edukacji Jiangxi (GJJ201449) oraz Wspólne Innowacje Nowoczesnych Badań Naukowych w Rolnictwie w Prowincji Jiangxi (JXXTCX2015002(3+2)-003).

1. Budowa CLas-DETECTR
UWAGA: Budowa CLas-DETECTR to czteroetapowy proces: przygotowanie roztworu, całkowita izolacja cytrusowego DNA, izotermiczna amplifikacja DNA i wizualizacja wyników. Schemat testu CLas-DETECTR jest zilustrowany na rysunku Rysunek 1A.
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu
	<ol>
		<li>Przygotować bufor A: 20 mM NaOH w 6% PEG 200. Na 100 ml dodać 113 mg NaOH i 6 g PEG 200 do 80 mlH2Ow butelce. Inkubować butelkę w łaźni wodnej w temperaturze 60 °C, aż do rozpuszczenia całego PEG 200. Następnie dodajH2Odo objętości 100 ml.</li>
		<li>Przygotować roztwór B: Do każdej reakcji dodać 10 μl buforu RPA, 0,8 μl F-RPA-RNRf, 0,8 μl R-RPA-RNRr i 3,9 μl ddH2O do końcowej objętości 15,5 μL. 
		UWAGA: F-RPA-RNRf i R-RPA-RNRr są starterami stosowanymi w teście przeciwko genowi nrdB. Sekwencja znajduje się w tabeli 1.</li>
		<li>Przygotować roztwór C: Do każdej reakcji dodać 1 μl reportera ssDNA, 3 μl buforu NEB 3.1, 1 μl crRNA, 4 μl Cas12a i 11 μl ddH2O do końcowej objętości 20 μl. 
		UWAGA: Jeśli do wykrycia jest wiele próbek, należy przygotować dużą objętość roztworu B i roztworu C, a następnie podwielokrotnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Całkowita izolacja DNA cytrusów 
	UWAGA: Aby zaoszczędzić czas i sprawić, by ta metoda była odpowiednia do wykrywania w terenie, zastosowano podejście oparte na alkalicznym glikolu polietylenowym (PEG) w celu uzyskania surowych ekstraktów roślinnych do amplifikacji DNA22,23
	<ol>
		<li>W tym protokole użyto liści cytrusowych. Najpierw przebij pięć krążków liściowych z liścia. Następnie umieść krążki liściowe w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i dodaj 200 μl buforu A. 
		UWAGA: Na polu najpierw wyczyść liście, jeśli pokrywa je kurz. Krążki liściowe można przypiąć za pomocą pokrywy tubki o pojemności 1,5 ml, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Inne tkanki cytrusowe, takie jak korzenie, łodygi, owoce i kwiaty, mogą być również używane w tym protokole.</li>
		<li>Zmiel krążki liściowe ręcznie, aż będą gładkie za pomocą plastikowego pręta.</li>
		<li>Pozostaw rurkę w spokoju na 10 minut. Następnie użyj supernatantu do amplifikacji DNA. 
		UWAGA: W tym miejscu test można wstrzymać, a surowe ekstrakty roślinne, które zostały wyekstrahowane metodą alkaliczną-PEG, można przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 rok. Drzewa słodkiej pomarańczy Newhall (Citrus sinensis Osbeck var. Newhall) pokazane na filmie były uprawiane w doniczce wypełnionej mieszanką gleby torfowej 9/3/1 (v/v/v) / wermikulitu / perlitu i utrzymywane w szklarni znajdującej się na terenie kampusu Gannan Normal University w Jiangxi w Chinach. Drzewa zainfekowane HLB zaszczepiono przez szczepienie CLas-dodatnimi pąkami Newhall. Drzewa zakażone i niezakażone HLB zostały potwierdzone metodą PCR. CLas wykryto przy użyciu pary starterów (F-RPA-RNRf/R-RPA-RNRr) ukierunkowanej na gen markera specyficzny dla CLas, nrdB. Z drugiej strony, charakterystyczne objawy HLB, plamiste plamistości i żółknięcie liści można znaleźć na drzewach CLas-dodatnich, ale nie na drzewach CLas-ujemnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izotermiczna amplifikacja DNA
	<ol>
		<li>Dodać 1 μl supernatantu z kroku 1.2.3 i 1 μl MgOAc (14 mM stężenie końcowe) do roztworu B i dobrze wymieszać.</li>
		<li>W laboratorium inkubować je w prostym inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 15 min. 
		UWAGA: W terenie trzymaj probówki w ręku przez 15 minut. Zaleca się również inkubację probówek w prostym inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 15 minut, jeśli pozwalają na to warunki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wizualizacja wyników
	<ol>
		<li>Dodać 10 μl mieszaniny z kroku 1.3.2 do roztworu C i dobrze wymieszać.</li>
		<li>Inkubować je w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 60 minut.</li>
		<li>Załóż gogle i obserwuj zielony sygnał fluorescencyjny uwalniany z reportera ssDNA znakowanego 5' 6-fluoresceiną na 5' i wygaszaczem fluorescencji na 3' przez ręczne urządzenie do wykrywania fluorescencji (długość fali wzbudzenia: 440 nm, długość fali emisji: 500 nm). 
		UWAGA: zielony sygnał fluorescencji może trwać kilka dni, lepiej 
		UWAGA: Światło emitowane przez urządzenie do wykrywania fluorescencji jest szkodliwe dla oczu. Upewnij się, że założyłeś okulary ochronne przed obserwacją wyników.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test specyficzności
UWAGA: Aby przetestować specyficzność CLas-DETECTR, bakterie ryzosfery Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) i Burkholderia stabilis szczep 1440 wyizolowane w lab24 zostały poddane testowi CLas-DETECTR. 
UWAGA: Candidatus Liberibacter (CLas) nie może być hodowany. DNA CLas można uzyskać tylko z ekstrakcji genomowego DNA z tkanek cytrusowych zakażonych CLas. Xcc jest czynnikiem sprawczym innej ważnej choroby cytrusów, raka cytrusów. Burkholderia stabilis szczep 1440 to bakteria anty-Xcc wyizolowana w laboratorium. W związku z tym użyto czystych szczepów dla wszystkich tych trzech bakterii
<ol>
	<li>Wyodrębnij bakteryjne genomowe DNA (gDNA) za pomocą zestawu do ekstrakcji bakteryjnego genomowego DNA zgodnie z protokołem producenta. Użyj wody jako kontroli negatywnej.</li>
	<li>Przeprowadzić PCR przy użyciu 0,2 ml pasków probówki PCR z nasadkami optycznymi w 25 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 1 μl F-RPA-RNRf, 1 μl R-RPA-RNRr, 12,5 μl Ex Taq wersja 2.0 plus barwnik, 1 μl matrycy DNA i 9,5 μlH2O.
	<ol>
		<li>Stosować następujące warunki reakcji z cyklami termicznymi: 1 min w temperaturze 98 °C, następnie 35 cykli po 10 s w temperaturze 98 °C, 30 s w temperaturze 55 °C, 15 s w temperaturze 72 °C, następnie 10 min w temperaturze 72 °C i utrzymywać w temperaturze 16 °C.</li>
		<li>Uruchom produkty PCR na 1% żelu agarozowym przy napięciu 120 V przez 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonać qPCR w 20 μL mieszaninie reakcyjnej zawierającej 0,8 μL F-RPA-RNRf, 0,8 μL R-RPA-RNRr, 10 μL 2x TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus), 1 μL matrycy DNA i 7,4 μLH2O.
	<ol>
		<li>Stosować następujące warunki reakcji z cyklicznymi zmianami termicznymi: 30 s w temperaturze 95 °C, następnie 45 cykli po 5 s w temperaturze 95 °C i 32 s w temperaturze 60 °C, a następnie etap krzywej topnienia trwający 15 s w temperaturze 95 °C, 1 min w temperaturze 60 °C i 15 s w temperaturze 95 °C.</li>
		<li>W każdym powtórzeniu należy uwzględnić trzy powtórzenia techniczne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj metodę CLas-DETECTR, wykonując kroki 1.1–1.4.</li>
</ol>
3. Porównanie czułości
<ol>
	<li>Aby przetestować czułość CLas DETECTR, wykryj serię rozcieńczeń fragmentów DNA CLas za pomocą PCR, CLas-DETECTR i qPCR, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Amplifikować segment DNA o długości 1,060 pz od nrdB przy użyciu zestawu starterów F-RNR i R-RNR w 100 μl mieszaninie reakcyjnej zawierającej 4 μl F-RNR, 4 μl R-RNR, 50 μl PrimeSTAR Max Premix, 2 μl matrycy DNA i 40 μlH2O, zgodnie z warunkami reakcji z cyklami termicznymi (30 s w temperaturze 98 °C, następnie 35 cykli po 10 s w temperaturze 98 °C, 15 s w temperaturze 55 °C, 30 s w temperaturze 72 °C, następnie 10 minut w temperaturze 72 °C, a następnie utrzymywanie w temperaturze 16 °C). 
	UWAGA: Gen nrdB (podjednostka reduktazy rybonukleotydowej β-) jest specyficzny dla CLas21. Amplikon nrdB można łatwo uzyskać z CLas-dodatniego gDNA cytrusowego za pomocą zestawu starterów F-RNR i R-RNR. Zestaw starterów F-RNR i R-RNR amplifikuje fragment nrdB o wartości 1,060 pz, podczas gdy zestaw starterów F-RPA-RNR i R-RPA-RNR amplifikuje fragment genu nrdB o wartości 104 pz, który jest częścią fragmentu nrdB o pz.</li>
	<li>Oczyść produkty PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu DNA zgodnie z instrukcją producenta.</li>
	<li>Rozcieńczyć produkty PCR zawierające amplikony nrdB wysterylizowanym ddH2O.</li>
	<li>Oblicz liczbę kopii genu nrdB, korzystając z dostępnego na rynku internetowego kalkulatora liczby kopii DNA i rozcieńczenia.</li>
	<li>Przygotować rozcieńczenia DNA zawierające 2,01 × 106 kopii/μL, 2,01 × 105 kopii/μL, 2,01 × 104 kopii/μL, 2,01 × 103 kopii/μL, 2,01 × 102 kopii/μL, 2,01 × 101 kopii/μL, 2,01 × 100 kopii/μL i 2,01 × 10−1 kopii/μL fragmentu DNA CLas.</li>
</ol>
4. Wykrywanie próbki
UWAGA: Po teście specyficzności i czułości, metoda CLas-DETECTR została użyta do wykrycia obecności CLas w próbkach liści polowych pobranych z drzew słodkiej pomarańczy Newhall uprawianych w szkółce zasobów plazmy zarodkowej na kampusie Gannan Normal University, Jiangxi, Chiny. W celu weryfikacji wyników wykonano qPCR.
<ol>
	<li>Przetestuj w sumie 15 drzew. Użyj wody jako kontroli negatywnej.</li>
	<li>Wykonaj metody CLas-DETECTR i qPCR zgodnie z powyższym opisem. 
	UWAGA: Ze względu na nierównomierną charakterystykę rozmieszczenia CLas w cytrusach, liście wykazujące objawy HLB zostały zebrane jako priorytet. Jeśli drzewo wyglądało zdrowo, liście zostały zebrane losowoCLas-DETECTR system działa poprawnie.</li>
</ol>

<ol><li>Ma, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrus+Huanglongbing+is+a+pathogen-triggered+immune+disease+that+can+be+mitigated+with+antioxidants+and+gibberellin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin.</a> Nature Communications. 13 (1), 529(2022).</li>
<li>Bové, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huanglongbing%3A+A+destructive%2C+newly-emerging%2C+century-old+disease+of+citrus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus.</a> Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).</li>
<li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Candidatus+Liberibacter-host+interface%3A+Insights+into+pathogenesis+mechanisms+and+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control.</a> Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).</li>
<li>Kim, J. S., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+copy+numbers+of+16S+rDNA+and+16S+rRNA+of+Candidatus+Liberibacter+asiaticus+and+the+implication+in+detection+in+planta+using+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Characterization of copy numbers of 16S rDNA and 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus and the implication in detection in planta using quantitative PCR.</a> BMC Research Notes. 2, 37(2009).</li>
<li>Maheshwari, Y., Selvaraj, V., Godfrey, K., Hajeri, S., Yokomi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+%26%2334%3BCandidatus+Liberibacter+asiaticus%26%2334%3B+and+Spiroplasma+citri+by+qPCR+and+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of &#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&#34; and Spiroplasma citri by qPCR and droplet digital PCR.</a> PLoS One. 16 (3), e0242392(2021).</li>
<li>Deng, X., Zhou, G., Li, H., Chen, J., Civerolo, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nested-PCR+detection+and+sequence+confirmation+of+%27Candidatus+Liberibacter+asiaticus%27+from+Murraya+paniculata+in+Guandong%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">Nested-PCR detection and sequence confirmation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' from Murraya paniculata in Guandong, China.</a> Plant Disease. 91 (8), 1051(2007).</li>
<li>Ding, F., Duan, Y., Yuan, Q., Shao, J., Hartung, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serological+detection+of+%27Candidatus+Liberibacter+asiaticus%27+in+citrus%2C+and+identification+by+GeLC-MS%2FMS+of+a+chaperone+protein+responding+to+cellular+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Serological detection of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens.</a> Scientific Reports. 6, 29272(2016).</li>
<li>Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+detection+of+Candidatus+Liberibacter+asiaticus%2C+a+causal+agent+of+citrus+Huanglongbing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Pathology+Journal%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Candidatus Liberibacter asiaticus, a causal agent of citrus Huanglongbing.</a> The Plant Pathology Journal. 34 (6), 499-505 (2018).</li>
<li>Ghosh, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+recombinase+polymerase+based+isothermal+amplification+combined+with+lateral+flow+assay+%28HLB-RPA-LFA%29+for+rapid+detection+of+%26%2334%3BCandidatus+Liberibacter+asiaticus%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of a recombinase polymerase based isothermal amplification combined with lateral flow assay (HLB-RPA-LFA) for rapid detection of &#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&#34;.</a> PLoS One. 13 (12), e0208530(2018).</li>
<li>Ravindran, A., Levy, J., Pierson, E., Gross, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+procedure+as+a+sensitive+and+rapid+method+for+detection+of+%27Candidatus+Liberibacter+solanacearum%27+in+potatoes+and+psyllids%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Development of a loop-mediated isothermal amplification procedure as a sensitive and rapid method for detection of 'Candidatus Liberibacter solanacearum' in potatoes and psyllids.</a> Phytopathology. 102 (9), 899-907 (2012).</li>
<li>Chertow, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+diagnostics+with+CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Next-generation diagnostics with CRISPR.</a> Science. 360 (6387), 381-382 (2018).</li>
<li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li>
<li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li>
<li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+and+portable+nucleic+acid+detection+platform+with+Cas13%2C+Cas12a%2C+and+Csm6%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6.</a> Science. 360 (6387), 439-444 (2018).</li>
<li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+and+visual+detection+of+SARS-CoV-2+using+all-in-one+dual+CRISPR-Cas12a+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay.</a> Nature Communications. 11 (1), 4711(2020).</li>
<li>Qian, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+detection+of+human+metapneumovirus+using+CRISPR-Cas12a+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Visual detection of human metapneumovirus using CRISPR-Cas12a diagnostics.</a> Virus Research. 305, 198568(2021).</li>
<li>Marques, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostics+of+infections+produced+by+the+plant+viruses+TMV%2C+TEV%2C+and+PVX+with+CRISPR-Cas12+and+CRISPR-Cas13%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Diagnostics of infections produced by the plant viruses TMV, TEV, and PVX with CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (7), 2384-2393 (2022).</li>
<li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+equipment-free+method+for+detecting+Phytophthora+infestans+in+the+field+using+a+lateral+flow+strip-based+recombinase+polymerase+amplification+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">A rapid, equipment-free method for detecting Phytophthora infestans in the field using a lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification assay.</a> Plant Disease. 104 (11), 2774-2778 (2020).</li>
<li>Lobato, I. M., O'Sullivan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinase+polymerase+amplification%3A+Basics%2C+applications+and+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances.</a> Trends in Analytical Chemistry. 98, 19-35 (2018).</li>
<li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-Cas12a-derived+biosensing+platform+for+the+highly+sensitive+detection+of+diverse+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules.</a> Nature Communications. 10 (1), 3672(2019).</li>
<li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unusual+five+copies+and+dual+forms+of+nrdB+in+%26%2334%3BCandidatus+Liberibacter+asiaticus%26%2334%3B%3A+Biological+implications+and+PCR+detection+application%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Unusual five copies and dual forms of nrdB in &#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&#34;: Biological implications and PCR detection application.</a> Scientific Reports. 6, 39020(2016).</li>
<li>Chomczynski, P., Rymaszewski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+polyethylene+glycol-based+method+for+direct+PCR+from+bacteria%2C+eukaryotic+tissue+samples%2C+and+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Alkaline polyethylene glycol-based method for direct PCR from bacteria, eukaryotic tissue samples, and whole blood.</a> BioTechniques. 40 (4), 454-458 (2006).</li>
<li>Yang, Y. G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+gene+amplification+from+Arabidopsis+leaves+using+Any+Direct+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system.</a> Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).</li>
<li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescent+reporter-based+evaluation+assay+for+antibacterial+components+against+Xanthomonas+citri+subsp.+citri%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 864963(2022).</li>
<li>Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+and+rapid+detection+of+citrus+Huanglongbing+pathogen+%28%27Candidatus+Liberibacter+asiaticus%27%29+using+Cas12a-based+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen ('Candidatus Liberibacter asiaticus') using Cas12a-based methods.</a> Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

W niniejszej pracy przedstawiono szybką i przenośną metodę wykrywania CLas o nazwie CLas-DETECTR, która łączy w sobie systemy RPA i CRISPR-Cas12a. Przepływ pracy jest zilustrowany na rysunku 1. CLas-DETECTR wykrywa CLas ze swoistością i czułością (Rysunek 2 i Rysunek 3). Ponadto, korzystając z próbek liści Newhall, CLas-DETECTR wykrywa CLas z taką samą czułością jak qPCR (ryc. 4). Warto...

Huanglongbing (HLB) jest jedną z najbardziej problematycznych chorób cytrusów na świecie1. HLB jest wywoływany przez kolonizujące łyko i wybredne bakterie Candidatus Liberibacter spp., w tym Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus i Ca. L. americanus2. Najbardziej rozpowszechnionym gatunkiem związanym z HLB w Chinach i USA jest CLas, który jest przenoszony przez azjatyckie psyllidy cytrusowe (Diaphorina citri) lub przez szczepienie3. Po zakażeniu CLas, drzewa cytrusowe wykazują spadek wzrostu aż do śmierci2. Typowymi objawami liści cytrusowych zakażonych CLas są plamiste plamistości, zielone wyspy (małe okrągłe ciemnozielone kropki), wypukłe korkowate żyłki na grubszych i skórzastych liściach oraz niejednolite żółknięcie pędów2. Ponadto owoce zakażone CLas wydają się małe i koślawe2.
Ponieważ żadna odmiana cytrusów nie jest odporna na HLB i nie ma terapeutycznego lekarstwa na HLB, zapobieganie HLB wymaga kwarantanny i izolacji drzew cytrusowych z dodatnim wynikiem CLas2,3. Dlatego wczesne wykrycie ma kluczowe znaczenie dla monitorowania i kwarantanny, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się CLas i zminimalizować straty ekonomiczne3. Ponadto konieczne jest czułe wykrywanie CLas ze względu na niskie miano CLas u roślin we wczesnym stadium infekcji3. W Chinach wykrywanie CLas jest zwykle przeprowadzane przez niektóre certyfikowane centra testowe. Jednak proces wykrywania trwa zwykle co najmniej 1 tydzień, a opłata za wykrycie jest wysoka. Dlatego, aby pomóc w monitorowaniu częstości występowania HLB
Do diagnozowania HLB4,5,6,7,8,9. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) i ilościowa reakcja PCR (qPCR) są najczęściej używanymi narzędziami do wykrywania CLas ze względu na ich wysoką czułość i swoistość4,5. Technologie te opierają się jednak w dużej mierze na drogich instrumentach i wysoko wykwalifikowanym personelu. Ponadto opracowano kilka metod amplifikacji izotermicznej, takich jak amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli (LAMP), jako atrakcyjne alternatywy dla konwencjonalnych metod PCR ze względu na ich prostotę, szybkość i niski koszt8,9,10. Jednak zastosowanie ich do dokładnego wykrywania CLas jest trudne ze względu na niespecyficzne sygnały wzmacniające, które mogą powodować wyniki fałszywie dodatnie.
RNA-guided CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated) wykrywanie kwasów nukleinowych na bazie endonukleazy zostało opracowane jako technologia diagnostyki molekularnej nowej generacji ze względu na jej wysoką czułość, swoistość i niezawodność11,12,13,14. Te technologie diagnostyczne CRISPR/Cas opierają się na aktywności nukleazy pobocznej białek Cas w celu rozszczepienia jednoniciowego DNA (ssDNA) zmodyfikowanego za pomocą fluorescencyjnego reportera i wygaszacza fluorescencji na każdym końcu oligonukleotydów, a także urządzenia do wykrywania fluorescencji w celu wychwycenia uwolnionego fluorescencyjnego reportera11,12. Aktywność nukleazy kilku efektorów Cas aktywowanych przez docelowy dupleks CRISPR RNA (crRNA) może bezkrytycznie rozszczepiać otaczające niedocelowe ssDNA11. CRISPR-Cas12a (zwany również Cpf 1), system CRISPR/Cas klasy 2 typu V-A, wykazuje kilka zalet w porównaniu z Cas9, takich jak mniejsza tolerancja niedopasowania i większa specyficzność13. System Cas12a/crRNA został zastosowany do czułego i swoistego wykrywania kwasów nukleinowych ludzkich patogenów i fitopatogenów14,15,16,17,18. Dlatego wykorzystanie systemu Cas12a/crRNA powinno umożliwić dokładne i czułe wykrywanie kwasu nukleinowego CLas.
Cas12a sam w sobie nie jest teoretycznie wystarczająco czuły, aby wykryć niskie poziomy kwasów nukleinowych. Dlatego, aby poprawić czułość wykrywania, detekcja CRISPR-Cas12a jest zwykle łączona z krokiem amplifikacji izotermicznej14,15. Amplifikacja polimerazy rekombinazy (RPA) umożliwia czułą i szybką izotermiczną amplifikację DNA w zakresie temperatur od 37 °C do 42 °C19.
Niedawno opracowano platformę detekcyjną o nazwie DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter), która łączy aktywność DNazy Cas12a z RPA i odczytem fluorescencji12 i wykazano, że wykrywa kwas nukleinowy z większą czułością20. Ponadto sygnał fluorescencyjny emitowany z próbek dodatnich można obserwować za pomocą ręcznego urządzenia do wykrywania fluorescencji w terenie.
Ponieważ amplifikowaliśmy DNA za pomocą RPA, zaprojektowaliśmy crRNA ukierunkowane na pięciokopijny gen nrdB (subjednostka reduktazy rybonukleotydowej β-) specyficzny dla CLas21, i zastosowaliśmy aktywność DNazy białka Cas12a, nazwaliśmy tę metodę wykrywania CLas CLas-DETECTR. W porównaniu z istniejącymi metodami wykrywania CLas, CLas-DETECTR jest szybki, dokładny, czuły i łatwy do wdrożenia.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu DNA AxyPrep</td><td>Corning</td><td>09319KE1</td><td>Chiny</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji bakteryjnego genomowego DNA</td><td>Solarbio</td><td>D1600</td><td>Chiny</td></tr><tr><td>EnGen LbCas12a&nbsp;</td><td>TOLOBIO</td><td>32104-01</td><td>Chiny</td></tr><tr><td>Ex Taq wersja 2.0 plus barwnik</td><td>TaKaRa</td><td>RR902A</td><td>Chiny</td></tr><tr><td>Ręczne urządzenie do wykrywania fluorescencyjnego&nbsp;</td><td>LUYOR</td><td>3415RG</td><td></td></tr><tr><td>Chiny Dziurkacz&nbsp;</td><td>Deli</td><td>114</td><td>Chiny</td></tr><tr><td>Octan magnezu, MgOAc</td><td>TwistDx</td><td>TABAS03KIT</td><td>UK</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>SCR</td><td>10019718</td><td>Chiny</td></tr><tr><td>Bufor NEB 3.1&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B7203</td><td>USA</td></tr><tr><td>Probówki paskowe PCR</td><td>LABSELECT</td><td>PST-0208-FT-C</td><td>Chiny</td></tr><tr><td>PEG 200&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P3015</td><td>USA</td></tr><tr><td>PrimeSTAR Max DNA Polymeras</td><td>TaKaRa</td><td>R045A</td><td>Chiny</td></tr><tr><td>Szybkie ładowanie Fioletowy 1 kb Plus Drabinka DNA&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>N0550S</td><td>USA</td></tr><tr><td>TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)</td><td>TaKaRa</td><td>RR820B</td><td>Chiny</td></tr><tr><td>TwistAmp Basic</td><td>TwistDx</td><td>TABAS03KIT</td><td>Wielka Brytania</td></tr></tbody></table>

wykrywanie candidatus liberibacter asiaticus do stosowania w terenie za pomocą amplifikacji polimerazy rekombinazy w połączeniu z crispr-cas12a

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

Wczesne wykrycie Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) przez hodowców cytrusów ułatwia wczesną interwencję i zapobiega rozprzestrzenianiu się choroby. Przedstawiono tutaj prostą metodę szybkiej i przenośnej diagnostyki Huanglongbing (HLB), która łączy amplifikację polimerazy rekombinazy i fluorescencyjny reporter wykorzystujący aktywność nukleazy w klastrach, regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeniach palindromicznych/CRISPR-associated 12a (CRISPR-Cas12a). Czułość tej techniki jest znacznie wyższa niż PCR. Co więcej, metoda ta wykazała podobne wyniki do qPCR, gdy użyto próbek liści. W porównaniu z konwencjonalnymi metodami detekcji CLas, przedstawiona tutaj metoda detekcji może być zrealizowana w 90 minut i działa w warunkach izotermicznych, które nie wymagają użycia maszyn PCR. Ponadto wyniki można wizualizować za pomocą ręcznego urządzenia do wykrywania fluorescencyjnego w terenie.

W niniejszej pracy opisano przenośną platformę CLas-DETECTR, łączącą systemy RPA i CRISPR-Cas12a w celu diagnostyki HLB w warunkach terenowych. Schemat CLas-DETECTR przedstawiono na Rysunku 1A.
Kiedy próbki liści z drzew Newhall zainfekowanych HLB i niezakazifkowanych HLB (Rycina 1B), w których obecność CLas została potwierdzona za pomocą PCR (Rycina 1C), poddano testowi CLas-DETECTR, w próbce zainfekowan...

W tej pracy opracowano szybką, czułą i przenośną metodę wykrywania Candidatus Liberibacter asiaticus, opartą na amplifikacji polimerazy rekombinazy w połączeniu z CRISPR-Cas12a.

Wykrywanie Candidatus Liberibacter asiaticus do stosowania w terenie za pomocą amplifikacji polimerazy rekombinazy w połączeniu z CRISPR-Cas12a

The early detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) by citrus growers facilitates early intervention and prevents the spread of disease. A ...

Huang long bing, w skrócie HLB. Jest to wyniszczająca choroba cytrusów na całym świecie. W krajach najbardziej produkujących cytrusy, takich jak Chiny i USA, HLB jest wywoływany przez bakterie Candidatus Liberibacter asiaticus, ograniczone do łyka, w skrócie CLas.Wczesne wykrycie CLa było ważne dla hodowców, ułatwiało wczesną interwencję i zapobiegało rozprzestrzenianiu się choroby. Dlatego opracowaliśmy nową metodę szybkiej i przenośnej diagnostyki HLB, łączącą się z amplifikacją polimerazy rekombinazy i systemem CRISPR-Cas12a. Nazwaliśmy go CLas-DETECTR.Czułość naszej platformy jest znacznie wyższa niż PCR. Co więcej, wykazuje podobny wynik w przypadku qPCR, gdy użyto próbek liści. W porównaniu z konwencjonalnymi detekcjami CLas, nasza metoda może być zakończona w 90 minut i działa w warunkach izotermicznych.Wynik można również zobrazować za pomocą ręcznego urządzenia do wykrywania fluorescencyjnego w terenie. CLas-DETECTR składa się z czterech etapów: przygotowania roztworu, całkowitej izolacji cytrusowego DNA, izotermicznej amplifikacji DNA oraz wyników wizualizacji. Schemat testu CLas-DETECTR jest zilustrowany tutaj.Bufor A, roztwór B i roztwór C przygotowuje się zgodnie z opisem w protokole. Aby zaoszczędzić czas i sprawić, by metoda ta nadawała się do terenowego wykrywania CLas, zastosowano podejście oparte na glikolu polietylenowym E. coli w celu uzyskania surowych ekstraktów roślinnych do amplifikacji DNA. W narzędziu używane są liście cytrusowe.Odbij kilka kawałków krążków liściowych od liścia. Włóż krążki liściowe do 1,5-mililitrowej tubki Eppendorfa. Następnie dodaj 200 mikrolitrów buforu A do probówki.Zmiel ręcznie krążki liściowe na gładką masę za pomocą plastikowego pręta. Pozostaw rurkę w spokoju na 10 minut. Supernatant jest następnie stosowany do amplifikacji DNA.W celu izotermicznej amplifikacji DNA dodać jeden mikrolitr supernatantu z kroku 2.3 i jeden mikrolitr octanu magnezu do roztworu B i dobrze wymieszać. W laboratorium inkubuj je w prostym inkubatorze pod kątem 37 stopni przez 15 minut. Aby zobrazować wyniki, dodaj 10 mikrolitrów mieszaniny z kroku 3.2 do roztworu C i dobrze wymieszaj.Inkubuj je w inkubatorze 37 stopni przez 60 minut. Załóż gogle i obserwuj zielony sygnał fluorescencyjny za pomocą ręcznego urządzenia do wykrywania fluorescencji. Aby przetestować specyficzność CLas-DETECTR, pierwsze czyste kolonie Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp.Do ekstrakcji ich genomowego DNA użyto cytrów, które jest patogenem raka cytrusów oraz szczepu Burkholderia stabilis 1440 wyizolowanego w naszym laboratorium. Następnie te trzy bakterie genomowe DNA i CLas-dodatnie DNA genomowe Newhalla zostały poddane testowi CLas-DETECTR. Aby przetestować czułość CLas-DETECTR, wykryto serię rozcieńczeń fragmentów DNA CLas za pomocą PCR, CLas-DETECTR i qPCR, jak opisano w protokole Po teście swoistości i czułości zastosowano metodę CLas-DETECTR w celu wykrycia obecności CLas w terenie.Próbki liści pobrane z drzewa słodkiej pomarańczy Newhall uprawianego w szkółce zasobów plazmy zarodkowej na terenie kampusu Gannan Normal University w Jiangxi w Chinach. Zastosowano również qPCR, przekonującą metodę wykrywania CLas zwykle stosowaną w laboratorium. Próbki liści z drzewa Newhall zakażonego i niezakażonego HLB, w którym potwierdzono obecność CLas w naszym laboratorium, poddano testowi CLas-DETECTR.Sygnał zielonej fluorescencji został przechwycony w próbce zakażonej HLB, ale nie w próbce niezakażonej HLB i kontroli negatywnej. Określiliśmy swoistość CLas-DETECTR za pomocą kwasów nukleinowych ekstrahowanych z innych bakterii. W teście CLas-DETECTR tylko gDNA wyekstrahowane z CLas-dodatnich liści Newhalla wykazywało zielone sygnały fluorescencyjne.gDNA wyekstrahowane z Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri i Burkholderia stabilis szczep 1440 nie miało takiego charakteru, co oznacza, że CLas-DETECTR może wykrywać CLas specyficznie. Przetestowaliśmy również czułość CLas-DETECTR przy użyciu serii rozcieńczeń DNA CLas, wymienionych w protokole.PCR może wykryć 201 kopii na megalitr. Z drugiej strony, CLas-DETECTR może wykryć 2,01 kopii na megalitr, co sugeruje jego dostępność jako czułej diagnostyki pola. qPCR może wykryć 0,201 kopii na megalitr, a wartość Ct jest wyższa niż 36.Tak więc CLas-DETECTR jest o dwa rzędy wielkości bardziej czuły niż tradycyjny PCR i o jeden rząd wielkości mniej czuły niż qPCR, gdy zastosowano rozcieńczone CLas specyficzne amplikony. Na koniec ponownie zbadano wykonalność CLas-DETECTR dla próbek terenowych i porównano jego czułość z qPCR. Widzimy to w liczbach.Widzimy, że wartość Ct jest wyższa niż 36, gdy stężenie CLas jest mniejsze niż 0,2 kopii na megalitr, co jest bardzo niskim stężeniem. Spośród 15 próbek, wartość Ct w próbkach 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 i 14 wykrytych za pomocą qPCR była mniejsza niż 36. Zaobserwowano wyraźne zielone sygnały fluorescencji.Z drugiej strony, gdy wartość Ct próbek 6, 7, 9, 12 i 15 wykrytych za pomocą qPCR nie była określona, nie zaobserwowano żadnych sygnałów zielonej fluorescencji. Ponadto zaobserwowano słabe zielone sygnały fluorescencyjne, gdy wartość CT próbki 5 i 11 wykrytej za pomocą qPCR była wyższa niż 36. Wyniki sugerują, że nasza platforma jest szybkim, solidnym i czułym narzędziem do diagnozowania HLB w terenie.

field-deployable-candidatus-liberibacter-asiaticus-detection-using

Research

JoVE Journal

Biology

Systemy CRISPR-Cas i białka anty-CRISPR zostały zintegrowane ze schematem bramek Boole'a u Saccharomyces cerevisiae. Nowe małe obwody logiczne wykazały się dobrą wydajnością i pogłębiły wiedzę zarówno na temat czynników transkrypcyjnych opartych na dCas9/dCas12a, jak i właściwości białek anty-CRISPR.

Genowe obwody cyfrowe oparte na systemach CRISPR-Cas i białkach anty-CRISPR

Prezentujemy protokół, który łączy amplifikację polimerazy rekombinazy z systemem CRISPR/Cas12a do wykrywania śladów wirusów DNA i tworzy przenośną mikroskopię smartfonów z klasyfikacją wspomaganą sztuczną inteligencją do wykrywania wirusów DNA w miejscu opieki nad pacjentem.

System detekcji wirusów DNA oparty na RPA-CRISPR/Cas12a-SPM i głębokim uczeniu

Tutaj prezentujemy krok po kroku przygotowanie premiksowanej, liofilizowanej amplifikacji izotermicznej opartej na rekombinazie i reakcji opartych na Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), które mogą być wykorzystane do wykrywania biomarkerów kwasów nukleinowych patogenów chorób zakaźnych lub innych markerów genetycznych.

Diagnostyka oparta na CRISPR w miejscu opieki nad pacjentem z wstępnie zmieszanymi i liofilizowanymi odczynnikami

Aby ułatwić szybkie i precyzyjne wykrywanie Acinetobacter baumannii, przedstawiamy protokół, który wykorzystuje amplifikację polimerazy rekombinazy (RPA) w połączeniu z endonukleazą LbaCas12a do identyfikacji infekcji A. baumannii.

Szybkie i swoiste wykrywanie zakażeń Acinetobacter baumannii za pomocą systemu opartego na amplifikacji polimerazy rekombinazy/Cas12a

W tym protokole ilustrowano test amplifikacji polimerazy rekombinazowej CRISPR/Cas12a do wykrywania inwazyjnego patogenu roślinnego, Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4.

Połączony test amplifikacji polimerazy rekombinazy CRISPR/Cas12a do wykrywania Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4

Tutaj opisujemy prostą i szybką procedurę wykrywania DNA z patogenów pszczół, takich jak Lotmaria passim i Nosema ceranae, przy użyciu lizy komórek gotowej do amplifikacji, amplifikacji polimerazy rekombinazy i testów CRISPR/Cas12a.

Wykrywanie DNA pasożytów trypanosomatydów i Nosema ceranae na miejscu poprzez alkaliczną lizę sprzężoną z systemem RPA/CRISPR/Cas12a

W niniejszym filmie przedstawiono techniki znakowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych oraz mezenchymalnych komórek macierzystych barwnikami fluorescencyjnymi. Technika ta może być wykorzystana do śledzenia in vivo przeszczepionych komórek macierzystych za pomocą obrazowania optycznego oraz do korelacji histopatologicznych z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej.

Znakowanie komórek macierzystych barwnikami fluorescencyjnymi do nieinwazyjnego wykrywania za pomocą obrazowania optycznego

Wprowadzenie technologii rekombinaz specyficznych dla miejsca (SSR) oraz systemu Cre/lox doprowadziło do licznych osiągnięć w biologii molekularnej i okazało się cennym narzędziem do oceny funkcji genów u zwierząt transgenicznych. W niniejszym wywiadzie omówiono mechanizm rekombinacji specyficznej dla miejsca za pomocą rekombinazy cyklizacyjnej (Cre) oraz sposób, w jaki zastosowanie tego enzymu doprowadziło do opracowania mutagenezy warunkowej, która wykazuje znaczące zalety w porównaniu z...

Zasady technologii rekombinaz specyficznych dla miejsca (SSR)

W niniejszej pracy raportujemy wytworzenie rekombinazy Tre za pomocą ukierunkowanej ewolucji molekularnej. Rekombinaza Tre rozpoznaje zdefiniowaną sekwencję docelową w obrębie sekwencji LTR prowirusa HIV-1, co prowadzi do wycięcia i całkowitego usunięcia prowirusa z zainfekowanych ludzkich komórek. Choć ukierunkowana ewolucja molekularna znajduje się wciąż w początkowej fazie rozwoju, pozwoli ona na tworzenie niestandardowych enzymów, które posłużą jako narzędzia chirurgii molekularnej i...

Ewolucja molekularna rekombinazy Tre

Obecne strategie walki z HIV-1 dążą do zahamowania cyklu życiowego wirusa, lecz nie eliminują skutecznie infekcji. W niniejszej pracy wykazujemy, że zmodyfikowana rekombinaza może efektywnie wycinać zintegrowane prowiralne DNA HIV-1 z genomu zainfekowanych komórek.

Wywiad: Wycinanie prowiralnego DNA HIV-1 przy użyciu ewoluowanej rekombinazy

Poznaj metodę CLas-DETECTR łączącą amplifikację polimerazy rekombinazy z CRISPR-Cas12a do szybkiego wykrywania Candidatus Liberibacter asiaticus w polowych warunkach. Ta technika umożliwia diagnostykę Huanglongbing w cytrusach w ciągu 90 minut.

Wykrywanie Candidatus Liberibacter asiaticus do stosowania w terenie za pomocą amplifikacji polimerazy rekombinazy w połączeniu z CRISPR-Cas12a (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie Candidatus Liberibacter asiaticus do stosowania w terenie za pomocą amplifikacji polimerazy rekombinazy w połączeniu z CRISPR-Cas12a

Przeglądaj więcej filmów