Name: Wizualizacja mitofagii za pomocą barwników fluorescencyjnych dla mitochondriów i lizosomów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji mitofagii w żywych komórkach za pomocą barwników fluorescencyjnych dla mitochondriów i lizosomów. Technika ta pozwala na ilościową ocenę mitofagii w komórkach fibroblastów zarodkowych myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została częściowo sfinansowana przez Narodowy Kluczowy Program Badań i Rozwoju Chin (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81970333,31901044,) oraz Program dla Profesora Specjalnego Mianowania w Szanghajskich Instytucjach Szkolnictwa Wyższego (GZ2020008).

1. Hodowla komórkowa i pasażowanie
UWAGA: Protokół jest opisany na przykładzie rutynowo hodowanych mysich fibroblastów embrionalnych (MEF).
<ol>
	<li>Hodować komórki MEF w 10-centymetrowych szalkach do hodowli komórkowych z 10 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i monitorować komórki pod mikroskopem przy 100-krotnym powiększeniu.</li>
	<li>Wykonaj rutynowe pasażowanie komórek.
	<ol>
		<li>Gdy komórki osiągną zbieżność 80%-90% (co 3 dni), przemyj komórki 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco. Następnie dodaj 2 ml 0,05% trypsyny-EDTA przez 1 minutę, aby zdysocjować komórki, a następnie 2 ml DMEM, aby zatrzymać działanie trypsyny-EDTA. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 100 x g przez 3 minuty i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml DMEM.</li>
		<li>Policzyć komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i szkiełek w komorze do liczenia komórek (patrz Tabela materiałów), a następnie zaszczepić 1,5 x 106 komórek w nowej 10-centymetrowej naczyniu do hodowli komórkowej zawierającej 10 ml DMEM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do testu mitofagicznego należy przygotować zawiesinę komórkową jak w kroku 1.2.1. Rozcieńczyć zawiesinę komórek do 1 x 105 komórek/ml w świeżym DMEM.</li>
	<li>Dodać 2 ml rozcieńczonej zawiesiny komórkowej do naczynia konfokalnego o średnicy 20 mm (patrz tabela materiałów) i wstrząsnąć szalką hodowlaną na "krzyż". Inkubować naczynie do hodowli komórkowych w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
</ol>
2. Barwienie mitochondriów
<ol>
	<li>Z zamrażarki w temperaturze -20 °C wyjąć porcje roztworu podstawowego barwnika mitochondrialnego o barwie fluorescencyjnej na zielono i barwnika lizosomu o czerwonej fluorescencji (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Przygotować roztwory robocze barwników, rozcieńczając roztwory podstawowe w stosunku 1:1,000 w DMEM i dobrze wymieszać. Na przykład dodaj po 2 μl po 1 mM barwnika mitochondrialnego i barwnika lizosomowego do 2 ml DMEM, aby uzyskać stężenie robocze 1 μM dla obu barwników.</li>
	<li>Usunąć pożywkę z naczynia do hodowli konfokalnej (krok 1.4). Dodać 1 ml roztworu barwiącego (przygotowanego w kroku 2.2), aby pokryć komórki. Umieścić naczynie do hodowli komórkowych w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 20-30 minut.</li>
</ol>
3. Obrazowanie konfokalne
<ol>
	<li>Przygotować 1 l buforu Krebs-Henseleit (KH) (138,2 mM NaCl, 3,7 mM KCl, 0,25 mM CaCl2, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM MgSO, 4,7H2 O, 15 mM glukozy i 21,85 mM HEPES; końcowe pH 7,4) i przechowywać w temperaturze 4 °C (do 1 miesiąca).</li>
	<li>W dniu obrazowania konfokalnego należy wcześniej wyjąć bufor KH z lodówki i podgrzać go do temperatury pokojowej (20 do 25 °C).</li>
	<li>Ustaw parametry oprogramowania do obrazowania mikroskopii konfokalnej (patrz tabela materiałów): W przypadku obrazów z podwójnym wzbudzeniem należy użyć wzbudzenia sekwencyjnego przy 488 nm i 543 nm i zbierać emisję odpowiednio przy 505-545 nm i >560 nm. 
	UWAGA: Ustaw ustawienia obrazowania w następujący sposób. Tryb skanowania: ramka; Prędkość: 9; Średnia: liczba, 1; Przyrost: od 450 do 600; Otworek: od 30 do 200; Laser: <10%. Najlepiej jest najpierw uruchomić oprogramowanie do obrazowania, a następnie całkowicie włączyć laser 488 nm. Laser o długości fali 543 nm musi być włączony i ustabilizowany przez 3-5 minut przed użyciem (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Wyjąć pożywkę zawierającą barwnik z inkubatora (krok 2.3) i dodać 1 ml buforu KH do naczynia.</li>
	<li>Aby wywołać mitofagię, należy potraktować komórki cyjankiem karbonylu-4-(trifluorometoksy)fenylohydrazonem (FCCP) w stężeniu 1 μM (stężenie końcowe) w buforze KH przez 10 minut w temperaturze pokojowej i natychmiast przystąpić do obrazowania komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego.</li>
	<li>Nałóż odpowiednią ilość oleju na górną część soczewki olejowej 63x (patrz Tabela materiałów). Umieść próbkę komórki na stoliku na próbkę mikroskopu konfokalnego i przesuń ją bezpośrednio nad soczewkę obiektywu.</li>
	<li>Użyj oprogramowania do obrazowania, aby znaleźć próbkę, klikając zakładkę Zlokalizuj w lewym górnym rogu interfejsu oprogramowania (Rysunek 1B). Wybierz zestaw filtrów zielonych dla eksperymentu.</li>
	<li>Użyj pokrętła regulacji zgrubnej, aby szybko ustawić ostrość, przesuwając soczewkę obiektywu w górę iw dół. Po tym, jak próbka komórki jest wyraźnie widoczna przez okular, wyszukaj i ustaw ostrość na obszarze pojedynczych komórek, a następnie przesuń go do środka pola view.</li>
	<li>Kliknij kartę Akwizycja w lewym górnym rogu interfejsu oprogramowania, aby uzyskać obrazy. Wybierz tylko kanał 488 nm i rozdzielczość klatki 1024 x 1024 dla podglądu.</li>
	<li>Kliknij kartę Na żywo w lewym górnym rogu, aby rozpocząć skanowanie na żywo. Dostosuj pole widzenia do najostrzejszego i dostosuj moc lasera, przesuwając suwak w lewo lub w prawo (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A). Utrzymuj ustawienie wzmocnienia poniżej 600, aby uniknąć prześwietlenia.</li>
	<li>Ustaw wartość otworka na 156, wartość wzmocnienia na 545, a wartość przesunięcia cyfrowego na 0.</li>
	<li>Wybierz najlepsze pole widzenia, sprawdź dwa kanały (488 nm i 543 nm) i wybierz rozdzielczość klatki 1024 x 1024. Kliknij przycisk Przyciągaj, aby uzyskać obrazy 2D. Zapisz pobrane obrazy. 
	UWAGA: Zielony barwnik mitochondriów ma pik wzbudzenia przy 490 nm i pik emisji przy 516 nm; Można go wzbudzić za pomocą lasera o długości fali 488 nm. Czerwony barwnik lizosomowy ma pik wzbudzenia przy 576 nm i pik emisji przy 590 nm; Można go wzbudzić za pomocą lasera o długości fali 543 nm.</li>
</ol>
4. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Otwórz zapisany obraz za pomocą ImageJ i zaimportuj do niego scalony obraz.</li>
	<li>Ręcznie policz liczbę żółtych kropek w każdej komórce, które wskazują, że lizosom pochłania mitochondria.</li>
</ol>

<ol><li>Tao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+mitochondria%3A+evolution%2C+function%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Animal mitochondria: evolution, function, and disease.</a> Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).</li>
<li>Henze, K., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+biology%3A+essence+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolutionary biology: essence of mitochondria.</a> Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).</li>
<li>Kiriyama, Y., Nochi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-+and+intercellular+quality+control+mechanisms+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Intra- and intercellular quality control mechanisms of mitochondria.</a> Cells. 7 (1), (2017).</li>
<li>Rossmann, M. P., Dubois, S. M., Agarwal, S., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+function+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial function in development and disease.</a> Disease Models & Mechanisms. 14 (6), 048912(2021).</li>
<li>Suliman, H. B., Piantadosi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+quality+control+as+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial quality control as a therapeutic target.</a> Pharmacological Reviews. 68 (1), 20-48 (2016).</li>
<li>Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+superoxide+and+hydrogen+peroxide+from+specific+mitochondrial+sites+under+different+bioenergetic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).</li>
<li>Zhao, R. Z., Jiang, S., Zhang, L., Yu, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+electron+transport+chain%2C+ROS+generation+and+uncoupling+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review).</a> International Journal of Molecular Medicine. 44 (1), 3-15 (2019).</li>
<li>Murphy, M. P., Hartley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+as+a+therapeutic+target+for+common+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Mitochondria as a therapeutic target for common pathologies.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (12), 865-886 (2018).</li>
<li>Fan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+quality+control+in+cardiomyocytes%3A+a+critical+role+in+the+progression+of+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial quality control in cardiomyocytes: a critical role in the progression of cardiovascular diseases.</a> Frontiers in Physiology. 11, 252(2020).</li>
<li>Ma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy%2C+mitochondrial+homeostasis%2C+and+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467(2020).</li>
<li>Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+and+regulation+of+the+divisome+for+mitochondrial+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission.</a> Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).</li>
<li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics%3A+fission+and+fusion+in+fate+determination+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics: fission and fusion in fate determination of mesenchymal stem cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 580070(2020).</li>
<li>Onishi, M., Yamano, K., Sato, M., Matsuda, N., Okamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+and+physiological+functions+of+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms and physiological functions of mitophagy.</a> The EMBO Journal. 40 (3), 104705(2021).</li>
<li>Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mitophagy+in+cellular+homeostasis%2C+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology.</a> Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).</li>
<li>Khaminets, A., Behl, C., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-dependent+and+independent+signals+in+selective+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-dependent and independent signals in selective autophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (1), 6-16 (2016).</li>
<li>Fritsch, L. E., Moore, M. E., Sarraf, S. A., Pickrell, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+and+receptor-dependent+mitophagy+pathways+and+their+implication+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin and receptor-dependent mitophagy pathways and their implication in neurodegeneration.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (8), 2510-2524 (2020).</li>
<li>Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+is+recruited+selectively+to+impaired+mitochondria+and+promotes+their+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy.</a> Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).</li>
<li>Lazarou, M., Jin, S. M., Kane, L. A., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+PINK1+binding+to+the+TOM+complex+and+alternate+intracellular+membranes+in+recruitment+and+activation+of+the+E3+ligase+Parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Role of PINK1 binding to the TOM complex and alternate intracellular membranes in recruitment and activation of the E3 ligase Parkin.</a> Developmental Cell. 22 (2), 320-333 (2012).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+receptor+FUNDC1+regulates+mitochondrial+dynamics+and+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Mitophagy receptor FUNDC1 regulates mitochondrial dynamics and mitophagy.</a> Autophagy. 12 (4), 689-702 (2016).</li>
<li>Ding, W. X., Yin, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy%3A+mechanisms%2C+pathophysiological+roles%2C+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis.</a> Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).</li>
<li>Parzych, K. R., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+autophagy%3A+morphology%2C+mechanism%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 20 (3), 460-473 (2014).</li>
<li>Hasegawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagosome-lysosome+fusion+in+neurons+requires+INPP5E%2C+a+protein+associated+with+Joubert+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Autophagosome-lysosome fusion in neurons requires INPP5E, a protein associated with Joubert syndrome.</a> The EMBO Journal. 35 (17), 1853-1867 (2016).</li>
<li>Presley, A. D., Fuller, K. M., Arriaga, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MitoTracker+Green+labeling+of+mitochondrial+proteins+and+their+subsequent+analysis+by+capillary+electrophoresis+with+laser-induced+fluorescence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B.+Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">MitoTracker Green labeling of mitochondrial proteins and their subsequent analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection.</a> Journal of Chromatography B. Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 793 (1), 141-150 (2003).</li>
<li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+lysosomes+in+live+cells+with+LysoTracker%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571(2011).</li>
<li>Pickles, S., Vigie, P., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+and+quality+control+mechanisms+in+mitochondrial+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance.</a> Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).</li>
<li>Ashrafi, G., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathways+of+mitophagy+for+quality+control+and+clearance+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria.</a> Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).</li>
<li>Berezhnov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+pH+modulates+autophagy+and+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).</li>
<li>Takemori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+mitophagy+using+LysoKK%2C+a+7-nitro-2%2C1%2C3-benzoxadiazole-%28arylpropyl%29benzylamine+derivative%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Visualization of mitophagy using LysoKK, a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine derivative.</a> Mitochondrion. 62, 176-180 (2022).</li>
<li>Maeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+live+imagers+MitoMM1%2F2+for+mitochondrial+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">The new live imagers MitoMM1/2 for mitochondrial visualization.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 562, 50-54 (2021).</li>
<li>Feng, X. R., Yin, W., Wang, J. L., Feng, L., Kang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+promotes+the+stemness+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mitophagy promotes the stemness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Experimental Biology and Medicine. 246 (1), 97-105 (2021).</li>
<li>Chu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+externalization+to+the+outer+mitochondrial+membrane+acts+as+an+elimination+signal+for+mitophagy+in+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).</li>
<li>Sentelle, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ceramide+targets+autophagosomes+to+mitochondria+and+induces+lethal+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy.</a> Nature Chemical Biology. 8 (10), 831-838 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Opisany tutaj protokół zapewnia metodę oceny i monitorowania dynamicznego procesu mitofagii w żywych komórkach, obejmującego autofagosomy, lizosomy i rozszczepienie mitochondriów, poprzez jednoczesne barwienie mitochondriami peromondrycznymi i barwnikami lizosomowymi. Metoda może być również stosowana do identyfikacji mitochondriów i oceny morfologii mitochondriów. Oba barwniki użyte w tym badaniu powinny być chronione przed światłem, należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania, a barwniki powinny być prze...

Mitochondria są elektrowniami prawie wszystkich komórek eukariotycznych1,2. Oprócz produkcji ATP poprzez fosforylację oksydacyjną, mitochondria odgrywają istotną rolę w innych procesach, takich jak bioenergetyka, homeostaza wapnia, wytwarzanie wolnych rodników, apoptoza i homeostaza komórkowa3,4,5. Ponieważ mitochondria generują reaktywne formy tlenu (ROS) z wielu kompleksów w łańcuchu transportu elektronów, są one stale stymulowane przez potencjalny stres oksydacyjny, który może ostatecznie prowadzić do uszkodzeń strukturalnych i dysfunkcji, gdy załamie się system obrony antyoksydacyjnej6,7. Stwierdzono, że dysfunkcja mitochondriów przyczynia się do wielu chorób, w tym zaburzeń metabolicznych, neurodegeneracji i chorób sercowo-naczyniowych8. Dlatego tak ważne jest utrzymanie zdrowych populacji mitochondriów i ich prawidłowego funkcjonowania. Mitochondria są wysoce plastycznymi i dynamicznymi organellami; ich morfologia i funkcja są kontrolowane przez mechanizmy kontroli jakości mitochondriów, w tym modyfikacje potranslacyjne (PTM) białek mitochondrialnych, biogenezę mitochondriów, fuzję, rozszczepienie i mitofagię9,10. Rozszczepienie mitochondriów, w którym pośredniczy białko 1 związane z dynaminą (DRP1), GTPaza z nadrodziny białek dynaminy, powoduje powstanie małych i okrągłych mitochondriów i izoluje dysfunkcyjne mitochondria, które mogą zostać oczyszczone i zdegradowane przez mitofagię11,12.
Mitofagia to proces komórkowy, który selektywnie degraduje mitochondria przez autofagię, zwykle występującą w uszkodzonych mitochondriach po urazie, starzeniu się lub stresie. Następnie mitochondria te są dostarczane do lizosomów w celu degradacji10. Tak więc mitofagia jest procesem katabolicznym, który pomaga utrzymać ilość i jakość mitochondriów w zdrowym stanie w szerokim zakresie typów komórek. Odgrywa kluczową rolę w przywracaniu homeostazy komórkowej w normalnych warunkach fizjologicznych i stresowych13,14. Komórki charakteryzują się złożonym mechanizmem mitofagii, który jest indukowany przez różne sygnały stresu komórkowego i zmian rozwojowych. Szlaki regulacyjne mitofagii są klasyfikowane jako zależne od ubikwityny lub zależne od receptora15,16; autofagia zależna od ubikwityny jest pośredniczona przez kinazę PINK1 i rekrutację ligazy ubikwityny Parkin E3 do mitochondriów17,18, podczas gdy autofagia zależna od receptora obejmuje wiązanie receptorów autofagii z łańcuchem lekkim białka LC3 związanym z mikrotubulami, który pośredniczy w mitofagii w odpowiedzi na uszkodzenie mitochondriów19.
Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) jest najczęściej używaną metodą i nadal jedną z najlepszych metod obserwacji i wykrywania mitofagii20. Cechami morfologicznymi mitofagii są autofagosomy lub autolizosomy powstałe w wyniku fuzji autofagosomów z lizosomami, które można zaobserwować na obrazach z mikroskopii elektronowej21. Słabością mikroskopii elektronowej (EM) jest jednak niemożność monitorowania dynamicznych procesów mitofagii, takich jak depolaryzacja mitochondriów, rozszczepienie mitochondriów oraz fuzja autofagosomów i lizosomów, w żywej komórce20. Tak więc ocena mitofagii poprzez obrazowanie żywych organelli jest atrakcyjną alternatywną metodą badań mitochondrialnych. Opisana tutaj technika obrazowania żywych komórek wykorzystuje dwa barwniki fluorescencyjne do barwienia mitochondriów i lizosomów. Kiedy zachodzi mitofagia, uszkodzone lub zbędne mitochondria pochłonięte przez autofagosomy są zabarwione na zielono przez barwnik mitochondrialny, podczas gdy czerwony barwnik barwi lizosomy. Fuzja tych autofagosomów i lizosomów, określanych jako autolizosomy, powoduje, że zielona i czerwona fluorescencja nakładają się na siebie i manifestują się jako żółte kropki, wskazując w ten sposób na występowanie mitofagii22. Barwnik mitochondriów przenikany przez komórkę (MitoTracker Green) zawiera łagodnie reagujące z tiolami ugrupowanie chlorometylowe, które oznacza mitochondria23. Aby oznaczyć mitochondria, komórki są po prostu inkubowane z barwnikiem, który dyfunduje pasywnie przez błonę plazmatyczną i gromadzi się w aktywnych mitochondriach. Ten barwnik mitochondriów może łatwo barwić żywe komórki i jest mniej skuteczny w barwieniu komórek utrwalonych aldehydem lub martwych. Barwnik lizosomowy (LysoTracker Red) to fluorescencyjna sonda kwasotropowa służąca do znakowania i śledzenia organelli kwasowych w żywych komórkach. Barwnik ten wykazuje wysoką selektywność w stosunku do organelli kwaśnych i może skutecznie znakować żywe komórki w stężeniach nanomolowych24.
Procedury użycia tych barwników fluorescencyjnych w żywych komórkach, w tym ładowanie barwników oraz wizualizacja mitochondriów i lizosomów, są przedstawione tutaj. Ta metoda może pomóc naukowcom w obserwacji mitofagii za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek. Może być również stosowany do ilościowego określania mitochondriów i lizosomów oraz oceny morfologii mitochondriów.

<table><tbody><tr><td>Automatyczny licznik komórek</td><td>Countstar</td><td>IC1000</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka z komorą do liczenia komórek</td><td>Countstar</td><td>12-0005-50</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana pożywka Eagle firmy Dulbecco (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy Dulbecco (DPBS)</td><td>Corning</td><td>21-031-CVC</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórek ze szklanym dnem (naczynie konfokalne)</td><td>NEST</td><td>801002</td><td></td></tr><tr><td>Obraz J (Rasband, NIH)</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Krebs&ndash; Bufor Henseleit(KHB)</td><td>Samodzielnie przygotowany</td>LysoTracker Red Invitrogen 1818430 100 &micro;<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> mol/L, barwnik lizosomowy o czerwonej fluorescencji</td></tr><tr><td>MitoTracker Green</td><td>Invitrogen</td><td>1842298</td><td>200 &micro; mol/L zapas, zielony fluorescencyjny barwnik mitochondrialny</td></tr><tr><td>Mysz Fibroblasty</td><td></td><td></td> embrionalne <td>Samodzielnie przygotowany</td></tr><tr><td>obiektyw (63-krotna soczewka olejowa)</td><td>ZEISS</td><td>ZEISS LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA 0,25%</td> <td>Gibico</td><td>Cat# 25200056</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS LSM 880 Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>ZEISS</td><td>ZEISS LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Oprogramowanie mikroskopowe 2.1 (konfokalne oprogramowanie do obrazowania mikroskopem)</td><td>ZEISS</td><td>ZEN 2.1</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja mitofagii za pomocą barwników fluorescencyjnych dla mitochondriów i lizosomów

Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome

Mitochondria, będące elektrowniami komórki, odgrywają ważną rolę w bioenergetyce, generowaniu wolnych rodników, homeostazie wapnia i apoptozie. Mitofagia jest głównym mechanizmem kontroli jakości mitochondriów i jest zwykle badana za pomocą obserwacji mikroskopowej, jednak testy mitofagii in vivo są trudne do wykonania. Ocena mitofagii poprzez obrazowanie żywych organelli jest alternatywną i niezbędną metodą badań mitochondrialnych. Protokół ten opisuje procedury stosowania barwnika mitochondriów o zielonej fluorescencji MitoTracker Green i barwnika lizosomu o czerwonej fluorescencji LysoTracker Red w żywych komórkach, w tym ładowanie barwników, wizualizację mitochondriów i lizosomu oraz oczekiwane wyniki. Przedstawiono również szczegółowe kroki oceny mitofagii w żywych komórkach, a także uwagi techniczne dotyczące ustawień oprogramowania mikroskopu. Ta metoda może pomóc naukowcom w obserwacji mitofagii za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek. Ponadto może być stosowany do ilościowego oznaczania mitochondriów i lizosomów oraz oceny morfologii mitochondriów.

MitoTracker Green jest zielono-fluorescencyjnym barwnikiem mitochondrialnym, który umożliwia precyzyjną lokalizację mitochondriów. Barwnik ten z łatwością barwi żywe komórki, natomiast jest mniej skuteczny w barwieniu komórek utrwalonych aldehydem lub martwych (Rycina 2). Czerwono-fluorescencyjny barwnik lizosomalny LysoTracker Red pozwala na znakowanie i śledzenie kwaśnych organelli lizosomalnych i barwi wyłącznie żywe komórki (Rycina 2). Obrazowanie za pomocą ...

Mitofagia jest głównym mechanizmem kontroli jakości mitochondriów. Jednak ocena mitofagii in vivo jest utrudniona ze względu na brak wiarygodnych testów ilościowych. Przedstawiono protokół obserwacji mitofagii w żywych komórkach przy użyciu barwnika mitochondriów o barwie zielonej fluorescencji i barwnika lizosomowego o czerwonej fluorescencji.

Wizualizacja mitofagii za pomocą barwników fluorescencyjnych dla mitochondriów i lizosomów

Mitochondria, being the powerhouses of the cell, play important roles in bioenergetics, free radical generation, calcium homeostasis, and apoptosis. ...

Metoda ta pomaga obserwować mitofagię w żywych komórkach za pomocą barwnika mitochondriów o zielonej fluorescencji i barwnika lizosomu o czerwonej fluorescencji. Mitofagia odgrywa ważną rolę w utrzymaniu homeostazy mitochondriów i różnych aspektów funkcji komórkowych. Technika ta może zapewnić nowe podejście do leczenia chorób związanych z mitochondriami.Ta procedura nie jest bardzo skomplikowana. Uchwycenie wyraźnych obrazów jest bardzo ważne dla zliczania nakładki mitochondriów i lizosomów. Na początek hoduj mysie fibroblasty embrionalne lub komórki MEF w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórek z 10 mililitrami zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium lub DMEM firmy Dulbecco.Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla i monitoruj komórki pod mikroskopem przy 100-krotnym powiększeniu. Gdy komórki osiągną zbieżność od 80 do 90%, przemyj je dwoma mililitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco. Następnie dodaj dwa mililitry 0,05% trypsyny EDTA na jedną minutę, aby zdysocjować komórki, a następnie dwa mililitry DMEM, aby zatrzymać reakcję.Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 100 G przez trzy minuty i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze DMEM. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i szkiełek komory do liczenia komórek i zaszczepij 1,5 razy 10 do szóstych komórek w nowej 10-centymetrowej naczyniu do hodowli komórkowej zawierającej 10 mililitrów DMEM. Do testu mitofagii przygotuj zawiesinę komórkową zgodnie z opisem i rozcieńczyć zawiesinę komórkową do jednego razy 10 do piątej komórki na mililitr świeżego DMEM.Dodaj dwa mililitry rozcieńczonej zawiesiny komórkowej do 20-milimetrowego naczynia konfokalnego i potrząśnij naczyniem na krzyż. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny. Przygotować roztwory robocze barwników, rozcieńczając roztwory podstawowe.Dodaj po dwa mikrolitry 0,2 milimolowego barwnika mitochondrialnego i 50 mikromolowego barwnika lizosomu do dwóch mililitrów DMEM, aby uzyskać stężenie robocze 0,2 mikromolowego barwnika mitochondrialnego i 50 nanomolowego barwnika lizosomowego. Usuń pożywkę z naczynia do hodowli konfokalnej i dodaj jeden mililitr roztworu barwiącego, aby pokryć komórki. Umieść naczynie do hodowli komórkowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 20 do 30 minut.Ustaw parametry oprogramowania do obrazowania mikroskopii konfokalnej. W przypadku obrazów z podwójnym wzbudzeniem należy użyć wzbudzenia sekwencyjnego przy 488 nanometrach i 543 nanometrach i zbierać emisję odpowiednio przy 505 do 545 nanometrach i większych niż 560 nanometrów. Wyjąć z inkubatora szalkę z podłożem hodowlanym zawierającą barwnik i dodać do naczynia jeden mililitr buforu Krebs-Henseleit lub KH.Aby wywołać mitofagię, należy potraktować komórki FCCP w jednym mikromolowym buforze KH przez 10 minut w temperaturze pokojowej i natychmiast przystąpić do obrazowania komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego. Nałóż odpowiednią ilość oleju na górną część soczewki olejowej 63X. Umieść próbkę na stoliku na próbkę mikroskopu konfokalnego i przesuń ją bezpośrednio nad soczewkę obiektywu.Użyj oprogramowania do obrazowania, aby znaleźć próbkę, klikając kartę Zlokalizuj w lewym górnym rogu interfejsu oprogramowania. Wybierz zestaw filtrów zielonych dla eksperymentu. Użyj pokrętła regulacji zgrubnej, aby szybko ustawić ostrość, przesuwając soczewkę obiektywu w górę iw dół.Po tym, jak próbka komórki jest wyraźnie widoczna przez okular, wyszukaj i ustaw ostrość na obszarze pojedynczych komórek, a następnie przesuń go do środka pola view. Kliknij kartę Akwizycja w lewym górnym rogu interfejsu oprogramowania, aby uzyskać obrazy. Wybierz tylko kanał 488 nanometrów i rozdzielczość klatki 1024 na 1024 dla podglądu.Kliknij kartę Na żywo w lewym górnym rogu, aby rozpocząć skanowanie na żywo. Dostosuj pole widzenia do najostrzejszego i dostosuj moc lasera, przesuwając suwak w lewo lub w prawo. Utrzymuj ustawienie wzmocnienia poniżej 600, aby uniknąć nadmiernej ekspozycji.Ustaw wartość otworka na 156, wartość wzmocnienia na 545 i wartość przesunięcia cyfrowego na zero. Wybierz najlepsze pole widzenia, sprawdź dwa kanały i wybierz rozdzielczość klatki 1024 na 1024. Kliknij przycisk Snap (Przyciągaj), aby uzyskać obrazy 2D i zapisać uzyskane obrazy.W tym badaniu FFCP zastosowano do wywołania mitofagii w komórkach MEF do obrazowania konfokalnego. Przedstawiono tutaj reprezentatywne obrazy komórek wybarwionych barwnikiem mitochondriów o zielonej fluorescencji pokazującym mitochondria i wybarwionych barwnikiem lizosomów o czerwonej fluorescencji pokazującym lizosom. Kiedy uszkodzone mitochondria zabarwione na zielono są pochłonięte przez zabarwione na czerwono lizosomy, zielona i czerwona fluorescencja nakładają się na siebie, odsłaniając żółte, kolokalizowane lizosomy mitochondriów.Żółte kropki odpowiadają tym kolokalizowanym lizosomom mitochondriów reprezentującym trwającą mitofagię, a zatem można je policzyć w celu oceny zakresu mitofagii. Przygotowanie roztworu roboczego barwników do barwienia mitochondriów i lizosomów oraz utrzymanie odpowiedniej konfluencji komórek podczas obrazowania za pomocą mikroskopii konfokalnej to kluczowe kroki, o których należy pamiętać. Procedura ta może być również wykorzystana do analizy liczby i morfologii mitochondriów, co jest ważne dla oceny dynamiki mitochondriów.Mitofagia jest ściśle związana z różnymi chorobami ludzkimi, a technika ta może być wykorzystana do zbadania związku między mitofagią a chorobami człowieka.

visualizing-mitophagy-with-fluorescent-dyes-for-mitochondria

Research

JoVE Journal

Biology

Opisano niezawodną metodę monitorowania transportu organelli do kwaśnego światła wakuoli drożdżowej w celu ich degradacji i recyklingu. Metoda ta opiera się na specyficznym znakowaniu docelowych organelli za pomocą genetycznie kodowanego dwuemisyjnego fluorescencyjnego biosensora pH oraz wizualizacji pojedynczych komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Analiza z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania mitofagii w drożdżach Saccharomyces cerevisiae

Tutaj szczegółowo opisujemy podejście do pomiaru czasowej rekrutacji EYFP-Parkiny za pomocą poklatkowej mikroskopii podczas selektywnego usuwania uszkodzonych mitochondriów. Ten dynamiczny proces usuwania uszkodzonych mitochondriów zależny od EYFP-Parkina może być wykorzystany jako wskaźnik zdrowia komórek w różnych warunkach eksperymentalnych.

Wideomikroskopia poklatkowa do oceny agregacji EYFP-Parkiny jako markera mitofagii komórkowej

Mitofagia, proces oczyszczania uszkodzonych mitochondriów, jest niezbędny do homeostazy mitochondriów i utrzymania zdrowia. W tym artykule przedstawiono niektóre z najnowszych metod wykrywania mitofagii w komórkach ludzkich, Caenorhabditis elegans i myszach.

Wykrywanie mitofagii in vitro i in vivo w komórkach ludzkich, C. elegans i myszach

Mitofagia, selektywna degradacja mitochondriów, jest związana z homeostazą mitochondriów i jest rozregulowana w różnych chorobach ludzkich. Jednak wygodne metody eksperymentalne do pomiaru aktywności mitofagii są bardzo ograniczone. Tutaj zapewniamy czuły test do pomiaru aktywności mitofagii za pomocą cytometrii przepływowej.

Czuły pomiar mitofagii za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu zależnego od pH reportera fluorescencyjnego mt-Keima

Ten artykuł ilustruje potężną metodę ilościowego oznaczania mitochondriów lub lizosomów w żywych komórkach. Połączenie barwników specyficznych dla lizosomów lub mitochondriów z fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym umożliwia ilościowe określenie tych organelli w mieszanych populacjach komórek, takich jak komórki pierwotne pobrane z próbek tkanek, przy użyciu wielobarwnej cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja mitochondriów i lizosomów w limfocytach T oparta na wielobarwnej cytometrii przepływowej

Badanie mitofagii za pomocą mikroskopii elektronowej, czujników genetycznych i immunofluorescencji wymaga kosztownego sprzętu, wykwalifikowanego personelu i znacznej inwestycji czasu. Tutaj pokazujemy skuteczność komercyjnego zestawu barwników fluorescencyjnych w ilościowym określaniu procesu mitofagii zarówno w Caenorhabditis elegans, jak i w linii komórkowej raka wątroby.

Wykrywanie mitofagii w Caenorhabditis elegans i komórkach ssaków przy użyciu barwników specyficznych dla organelli

Ten protokół przedstawia dwie metody analizy ilościowej mitofagii w komórkach β trzustki: pierwsza, kombinacja przepuszczalnych dla komórek barwników specyficznych dla mitochondriów, a druga, genetycznie kodowany reporter mitofagii. Te dwie techniki są komplementarne i mogą być wdrażane w zależności od konkretnych potrzeb, co pozwala na elastyczność i precyzję w ilościowym podejściu do kontroli jakości mitochondriów.

Uzupełniające podejścia do badania strumienia mitofagii w komórkach β trzustki

Ten protokół opisuje mechanizm użycia światła korelacyjnego i mikroskopii elektronowej do wizualizacji interakcji mitochondriów i lizosomów znakowanych odpowiednio mEosEM i APEX2.

Dwukolorowa korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa do wizualizacji interakcji między mitochondriami a lizosomami

Ten protokół umożliwia reprodukowalną wizualizację kropli lipidowych i dynamiki organelli podczas mitozy z wykorzystaniem zsynchronizowanych komórek hepatomu.

Metoda oparta na fluorescencji do wizualizowania dynamiki kropelek lipidowych i organelli podczas mitozy w komórkach hepatoma

W niniejszym filmie przedstawiono techniki znakowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych oraz mezenchymalnych komórek macierzystych barwnikami fluorescencyjnymi. Technika ta może być wykorzystana do śledzenia in vivo przeszczepionych komórek macierzystych za pomocą obrazowania optycznego oraz do korelacji histopatologicznych z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej.

Znakowanie komórek macierzystych barwnikami fluorescencyjnymi do nieinwazyjnego wykrywania za pomocą obrazowania optycznego

Poznaj metodę wizualizacji mitofagii w żywych komórkach za pomocą barwników fluorescencyjnych dla mitochondriów i lizosomów. Technika ta pozwala na ilościową ocenę mitofagii w komórkach fibroblastów zarodkowych myszy.

Wizualizacja mitofagii za pomocą barwników fluorescencyjnych dla mitochondriów i lizosomów

Przeglądaj więcej filmów