Name: Internetowy przepływ pracy do wyboru wzmacniaczy specyficznych dla genów i tkanek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-18T13:10:10.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji wzmacniaczy specyficznych dla tkanek bez kodowania, wykorzystującą dane histonowe H3K4me1, H3K27ac oraz Hi-C. Protokół oparty na przeglądarce Ensembl umożliwia biologom odkrywanie elementów regulacyjnych związanych z genami, takimi jak TBX5.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium Ramialison (Transkryptomika i Bioinformatyka, reNEW Bioinformatics Hub) za pomocne dyskusje. MR i HTN są wspierane przez NHMRC Ideas Grant (APP1180905). Dziękujemy Richardowi Saffery'emu za wsparcie. MR jest finansowany przez Heart Foundation Future Leader Fellowship (107328). Dodatkowe fundusze na infrastrukturę dla Murdoch Children's Research Institute zostały zapewnione przez australijski rządowy National Health and Medical Research Council Independent Research Institute Infrastructure Support Scheme. Australijski Instytut Medycyny Regeneracyjnej jest wspierany przez dotacje rządu stanowego Wiktorii i rządu australijskiego. Centrum Medycyny Komórek Macierzystych Fundacji Novo Nordisk jest wspierane przez granty Fundacji Novo Nordisk (NNF21CC0073729).

UWAGA: Przewodnik krok po kroku jest dostępny na stronie https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow. Dane wykorzystane w protokole podsumowano w tabelach 1 i 2. Rozwiązywanie problemów jest dostępne w pliku uzupełniającym 1.

1. Lokalizacja rządu Indii (rysunek 1)

<ol>
	<li>Otwórz przeglądarkę genomu EnsEMBL (https://www.EnsEMBL.org).</li>
	<li>Wybierz odpowiedni zestaw genomu pasujący do gatunku i wersji.</li>
	<li>Wpisz GoI w polu wyszukiwania i kliknij Przejdź.</li>
	<li>Wybierz link do odpowiedniego identyfikatora genu EnsEMBL.</li>
	<li>Kliknij link do przeglądarki Region w zakładce szczegółów, znajdującej się poniżej sekcji podsumowania, aby nawigować po regionie otaczającym GoI.</li>
</ol>

2. Definiowanie obszaru detekcji wzmacniacza (rysunek 2)

<ol>
	<li>Zidentyfikuj dwa sąsiednie geny rządu Indii, aby zdefiniować region wykrywania. Użyj ścieżki Gene Legend, aby wyszukać te geny, które są oznaczone jako elementy wizualne związane ze scalonymi EnsEMBL/Havana w Basic Gene Annotations from GENCODE track. Określ kierunkowość GoI za pomocą znaków < i > na odpowiedniej nazwie genu na ścieżce GENCODE.</li>
	<li>Kliknij i przeciągnij, aby zaznaczyć region międzygenowy między tymi genami, a następnie kliknij przycisk Przejdź do regionu w wyskakującym okienku, aby wyświetlić wybrany obszar. Zdefiniuj ponownie obszar zainteresowania w dowolnym momencie, powtarzając ten krok.</li>
	<li>(OPCJONALNIE) Dostosuj wyświetlanie , wybierając opcję Dodaj/usuń ścieżki w górnej części przeglądarki ścieżek. Moduluj poziom powiększenia za pomocą elementów sterujących zoomem/nawigacją nad przeglądarką ścieżek.  </li>
</ol>

3. Analiza znaku histonowego (ryc. 3)

<ol>
	<li>Na pasku bocznym przeglądarki kart Region w szczegółach wybierz opcję Konfiguruj tę stronę.</li>
	<li>Na pasku bocznym karty Konfiguruj obraz regionu , w menu rozwijanym Regulacja , wybierz opcję Aktywność według komórki/tkanki.</li>
	<li>Użyj paska wyszukiwania Komórka/tkanka, aby wyszukać i wybrać interesujące Cię tkanki. Możesz też użyć alfabetycznego paska nawigacyjnego pod paskiem wyszukiwania, aby znaleźć interesujące Cię tkanki.</li>
	<li>Wybierz kartę Eksperymenty obok pozycji Komórka/tkanka.</li>
	<li>Wybierz H3K4me1 i H3K27ac jako marker wzmacniaczy oraz H3K4me3 jako marker promotorów.</li>
	<li>Wybierz opcję Konfiguruj wyświetlanie ścieżki.</li>
	<li>Wybierz opcję Wyświetl ścieżki , aby wyświetlić regiony oznaczone H3K4me1 w regionie wykrywania wzmacniacza i regiony oznaczone H3K4me3 przed GoI.</li>
	<li>W przypadku kandydatów na wzmacniacze pobierz współrzędne regionów genomu oznaczonych przez H3K4me1 w zdefiniowanych regionach detekcji, klikając kolorowe elementy wizualne/ramkowe w nowo dodanych ścieżkach H3K4me1. Spowoduje to ujawnienie wyskakującego okienka "Hists & Pols", które zawiera informacje na temat lokalizacji genomowej pierwiastka w parze zasad (bp).<ol>
		<li>Uzyskaj kandydatów na aktywne wzmacniacze, wybierając regiony H3K4me1, w których kolorowe elementy wizualne/ramkowe zarówno H3K4me1, jak i H3K27ac nakładają się na siebie. Stopień szczegółowości poziomu powiększenia może mieć wpływ na liczbę kandydatów na wzmacniacze pokazanych na tej ścieżce.</li>
		<li>Alternatywnie można ręcznie zdefiniować obszary zainteresowania dla każdej cechy genomowej, klikając i przeciągając ścieżkę, aby hermetyzować piki grafu pod ścieżką H3K4me1/H3K27ac. Skopiuj współrzędne lokalizacji genomu do pliku tekstowego i zapisz w formacie .bed .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podobnie, w przypadku regionów promotora, powtórz krok 3.8 przy użyciu ścieżki H3K4me3, koncentrując się na regionie powyżej rządu Indii.</li>
</ol>

4. Analiza wychwytywania konformacji chromatyny (Hi-C) (ryc. 4)

<ol>
	<li>Uzyskaj dostęp do portalu danych 4DN (https://data.4dnucleome.org/). Na głównym skumulowanym wykresie słupkowym na stronie głównej 4DN (Rysunek 5) upewnij się, że jako oś Y wybrano pozycję Experiment Sets (Zestawy eksperymentów ), jako oś X ( Typ eksperymentu ) wybrano pozycję Experiment Type (Typ eksperymentu), a wykres jest pogrupowany według pola Organism (Organizm).</li>
	<li>Wzdłuż osi X głównego wykresu słupkowego znajdź słupek Hi-C in situ. Kliknij część paska, która jest zgrupowana dla zestawów eksperymentów na ludziach, a następnie kliknij przycisk Przeglądaj w wyskakującym okienku. Filtruj odpowiednie zestawy danych za pomocą panelu po lewej stronie.</li>
	<li>Kliknij link w kolumnie Tytuł odpowiedniej próbki biologicznej dla tkanki będącej przedmiotem zainteresowania.</li>
	<li>Kliknij pozycję Eksploruj dane na karcie Przetworzone pliki , aby bardziej szczegółowo zapoznać się z zestawem danych Hi-C.  </li>
	<li>Wprowadź współrzędne zidentyfikowanego promotora w tkance będącej przedmiotem zainteresowania (od kroku 3.9) i zaznacz region poziomo, klikając prawym przyciskiem myszy mapę cieplną (Rysunek 4). Dodane linie zapewniają, że region promotora jest wizualnie śledzony na mapie cieplnej. Usuń przypadkowe linie, klikając linię prawym przyciskiem myszy i wybierając linię poziomą/pionową i Zamknij serię.</li>
	<li>Wprowadź współrzędne wszystkich zwalidowanych eksperymentalnie wzmacniaczy kontrolnych23 , aby obliczyć próg interakcji na podstawie ich minimum. Wcześniej potwierdzono, że te wzmacniacze kontroli wchodzą w interakcje z regionem promotora, służąc jako punkty odniesienia do definiowania minimalnej znaczącej interakcji.</li>
	<li>Zdefiniuj próg promotora-wzmacniacza, używając wzmacniaczy kontrolnych, w oparciu o najniższy niezerowy wynik interakcji zgodnie z kluczem koloru po prawej stronie macierzy.</li>
	<li>Wprowadź współrzędne genomowe wszystkich regionów związanych z H3K4me1 (z kroku 3.8) i zaznacz pionowo na mapie cieplnej Hi-C. Pozwala to na uzyskanie wzorca kontroli krzyżowej, w którym przecięcie między wzmacniaczami oznaczonymi H3K4me1 (pionowo) a regionem promotora (poziomym) może być zbadane pod kątem istotnych interakcji.<ol>
		<li>Następnie odfiltruj słabo oddziałujące regiony, porównując wyniki interakcji regionów oznaczonych H3K4me3 z progiem interakcji (krok 4.6).  </li>
		<li>Wybierz współrzędne genomowe, które wykazują częstości interakcji wyższe niż zdefiniowany próg na mapie cieplnej portalu 4DN. Obszary te pojawiają się jako bardziej skoncentrowane (ciemniejsze) sygnały na mapie cieplnej, z wyjątkiem formatu BED.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Barral, A., Déjardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+signatures+of+enhancers+and+their+dynamic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">The chromatin signatures of enhancers and their dynamic regulation.</a> Nucleus. 14 (1), 2160551(2023).</li>
<li>Pennacchio, L. A., Bickmore, W., Dean, A., Nobrega, M. A., Bejerano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancers%3A+five+essential+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Enhancers: five essential questions.</a> Nat Rev Genet. 14 (4), 288-295 (2013).</li>
<li>Kleinjan, D. A., van Heyningen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+control+of+gene+expression%3A+emerging+mechanisms+and+disruption+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Long-range control of gene expression: emerging mechanisms and disruption in disease.</a> Am J Hum Genet. 76 (1), 8-32 (2005).</li>
<li>Kvon, E. Z., Waymack, R., Gad, M., Wunderlich, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+redundancy+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Enhancer redundancy in development and disease.</a> Nat Rev Genet. 22 (5), 324-336 (2021).</li>
<li>Smith, E., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+biology+and+enhanceropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Enhancer biology and enhanceropathies.</a> Nat Struct Mol Biol. 21 (3), 210-219 (2014).</li>
<li>Sur, I., Taipale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+enhancers+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The role of enhancers in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 16 (8), 483-493 (2016).</li>
<li>Panigrahi, A., O'Malley, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+enhancer+action%3A+the+known+and+the+unknown%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of enhancer action: the known and the unknown.</a> Genome Biol. 22 (1), 108(2021).</li>
<li>Bulger, M., Groudine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+mechanistic+diversity+of+distal+transcription+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional and mechanistic diversity of distal transcription enhancers.</a> Cell. 144 (3), 327-339 (2011).</li>
<li>Krivega, I., Dean, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+and+promoter+interactions-long+distance+calls%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Enhancer and promoter interactions-long distance calls.</a> Curr Opin Genet Dev. 22 (2), 79-85 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+connectivity+maps+reveal+dynamic+promoter-enhancer+long-range+associations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromatin connectivity maps reveal dynamic promoter-enhancer long-range associations.</a> Nature. 504 (7479), 306-310 (2013).</li>
<li>Fang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+long-range+chromatin+interactions+by+proximity+ligation-assisted+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq.</a> Cell Res. 26 (12), 1345-1348 (2016).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).</li>
<li>Thurman, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+accessible+chromatin+landscape+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The accessible chromatin landscape of the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+and+predictive+chromatin+signatures+of+transcriptional+promoters+and+enhancers+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome.</a> Nat Genet. 39 (3), 311-318 (2007).</li>
<li>Visel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+accurately+predicts+tissue-specific+activity+of+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers.</a> Nature. 457 (7231), 854-858 (2009).</li>
<li>Belton, J. -M., McCord, R. P., Gibcus, J. H., Naumova, N., Zhan, Y., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C%3A+a+comprehensive+technique+to+capture+the+conformation+of+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Hi-C: a comprehensive technique to capture the conformation of genomes.</a> Methods. 58 (3), 268-276 (2012).</li>
<li>de Wit, E., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+3C+technologies%3A+insights+into+nuclear+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization.</a> Genes Dev. 26 (1), 11-24 (2012).</li>
<li>Gao, T., Qian, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EnhancerAtlas+2.0%3A+an+updated+resource+with+enhancer+annotation+in+586+tissue%2Fcell+types+across+nine+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">EnhancerAtlas 2.0: an updated resource with enhancer annotation in 586 tissue/cell types across nine species.</a> Nucleic Acids Res. 47 (D1), D117-D123 (2019).</li>
<li>Erwin, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+diverse+datasets+improves+developmental+enhancer+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrating diverse datasets improves developmental enhancer prediction.</a> PLoS Comput Biol. 10 (6), e1003677(2014).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Spicuglia, S., Vanhille, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+signatures+of+active+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Chromatin signatures of active enhancers.</a> Nucleus. 3 (2), 126-131 (2012).</li>
<li>Borsari, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancers+with+tissue-specific+activity+are+enriched+in+intronic+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Enhancers with tissue-specific activity are enriched in intronic regions.</a> Genome Res. 31 (8), 1325-1336 (2021).</li>
<li>Smemo, S., Campos, L. C., Moskowitz, I. P., Krieger, J. E., Pereira, A. C., Nobrega, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+variation+in+a+TBX5+enhancer+leads+to+isolated+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulatory variation in a TBX5 enhancer leads to isolated congenital heart disease.</a> Hum Mol Genet. 21 (14), 3255-3263 (2012).</li>
<li>Boogerd, C. J., Evans, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TBX5+and+NuRD+divide+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">TBX5 and NuRD divide the heart.</a> Dev Cell. 36 (3), 242-244 (2016).</li>
<li>Dickel, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+compendium+and+functional+assessment+of+in+vivo+heart+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genome-wide compendium and functional assessment of in vivo heart enhancers.</a> Nat Commun. 7 (1), 12923(2016).</li>
<li>Pennacchio, L. A., Visel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limits+of+sequence+and+functional+conservation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Limits of sequence and functional conservation.</a> Nat Genet. 42 (7), 557-558 (2010).</li>
<li>Local, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+H3K4me1-associated+proteins+at+mammalian+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of H3K4me1-associated proteins at mammalian enhancers.</a> Nat Genet. 50 (1), 73-82 (2018).</li>
<li>Creyghton, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K27ac+separates+active+from+poised+enhancers+and+predicts+developmental+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).</li>
<li>Visel, A., Minovitsky, S., Dubchak, I., Pennacchio, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VISTA+Enhancer+Browser-a+database+of+tissue-specific+human+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">VISTA Enhancer Browser-a database of tissue-specific human enhancers.</a> Nucleic Acids Res. 35 (Database), D88-D92 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie deklarują braku sprzecznych interesów.

Opisany tutaj protokół internetowy funkcjonuje jako przepływ pracy do pobierania wzmacniacza, a nie przewidywania wzmacniacza. Wykorzystując publicznie dostępne zestawy danych specyficznych dla tkanki, modyfikacje histonów (H3K4me1 i H3K27ac) oraz dane dotyczące interakcji Hi-C, zawęża potencjalne wzmacniacze związane z GoI. W przeciwieństwie do narzędzi predykcyjnych obliczeniowych, które opierają się na uczeniu maszynowym lub modelach opartych na sekwencjach, nasze podejście koncentruje się na pobieraniu wzmacniaczy tylko na podstawie danych eksperymentalnych. Instrukcje rozwiązywania problemów z przeglądarką genomu EnsEMBL znajdują się w pliku uzupełniającym 1.
Ten przepływ pracy integruje kluczowe elementy, takie jak znaczniki histonowe i dane dotyczące interakcji chromatyny, podobnie jak w przypadku zaawansowanych metod, takich jak ChIA-PET i PLAC-seq, które mapują interakcje wzmacniacz-promotor z większą dokładnością10,11. Jednak ta metoda jest korzystna, gdy techniki eksperymentalne o wysokiej rozdzielczości nie są wykonalne, ponieważ protokół jest mniej zasobożerny i oszczędza znaczną ilość czasu.
Podstawowym ograniczeniem przedstawionego powyżej podejścia jest jego zależność od dostępności i jakości istniejących zbiorów danych, co może mieć wpływ na precyzję pobieranych interakcji. Badanie aktywności wzmacniacza podczas rozwoju serca w kontekście mutacji genetycznych związanych z TBX5 wymaga rozdzielczości specyficznej dla tkanki. Do takiej analizy najodpowiedniejsza byłaby embrionalna tkanka serca ze względu na jej znaczenie dla regulacji rozwoju. Jednak żadne zestawy danych embrionalnych nie zawierały danych dotyczących modyfikacji histonów, które były publicznie dostępne w czasie analizy. Aby to uwzględnić, integracja alternatywnych zasobów, takich jak ENCODE, Enhancer Atlas 2.0 lub EnhancerFinder, może rozszerzyć użyteczność potoku, dostarczając dodatkowe zestawy danych do identyfikacji i walidacji wzmacniacza18,19.
W TBX5 REPFIX analiza oparta na H3K4me1 ujawniła 22 przypuszczalne wzmacniacze jako punkt wyjścia do dalszych badań. Późniejsza analiza Hi-C wykazała, że 21 z 22 kandydatów na wzmacniacze oparte na wcześniejszych znacznikach modyfikacji histonów oddziaływało z promotorem TBX5 w komórkach mięśnia sercowego (Figura 5). Potwierdza to wiarygodność podejścia opartego na znacznikach modyfikacji histonów w przewidywaniu obszarów zainteresowania.
Zdecydowaliśmy się nie traktować priorytetowo ochrony sekwencji między gatunkami w tym protokole, chociaż jest to powszechne kryterium identyfikacji wzmacniaczy. Jak już wcześniej okazało się, jest mniej skuteczny w przypadku wzmacniaczy specyficznych dla tkanek lub gatunków, z których wiele nie jest silnie konserwatywnych podczas ewolucji26. Biorąc to pod uwagę, zdecydowaliśmy się skupić na markerach opartych na chromatynie, które bardziej bezpośrednio wskazują na aktywność wzmacniacza funkcjonalnego. Jednak zachowanie sekwencji może nadal mieć wartość w określonych kontekstach, takich jak badanie wzmacniaczy o znaczeniu ewolucyjnym. W takim przypadku można go dodać jako opcjonalny krok dla użytkowników zainteresowanych zachowanymi elementami regulacyjnymi.
Protokół okazał się skuteczny w pobraniu 21 specyficznych dla serca wzmacniaczy genu TBX5 ze strony internetowej EnsEMBL, która wcześniej wymykała się identyfikacji przez istniejącą platformę, VISTA Cardiac Enhancers Browser. Chociaż opisany tutaj protokół nie był w stanie pobrać jednego ze wzmacniaczy, hs498, co sugeruje możliwość ograniczenia w wykrywaniu, podejście ujawniło niektóre wzmacniacze, które nie zostały wykryte przez przeglądarkę VISTA Cardiac Enhancers. Konieczna jest jednak dalsza walidacja pobranych wzmacniaczy, ponieważ protokół daje większą liczbę przypuszczalnych regionów w porównaniu z wyselekcjonowanymi bazami danych VISTA. Ta wyższa liczba zwiększa ryzyko wyników fałszywie dodatnich, a większa liczba przewidywanych wzmacniaczy niekoniecznie wskazuje na poprawę swoistości lub znaczenia funkcjonalnego. Włączenie dodatkowych eksperymentalnych zestawów danych lub testów funkcjonalnych, takich jak analiza ekspresji genów, perturbacja CRISPR lub testy reporterowe, będzie miało kluczowe znaczenie dla potwierdzenia biologicznej ważności tych kandydatów, jak przeprowadzono w Smemoi wsp.Badanie23.
Porównanie krzyżowe z trzema eksperymentalnie zwalidowanymi wzmacniaczami wykazało częściowe pokrywanie się z przewidywanymi regionami (Figura 5). Przewidywany wzmacniacz "e1" był szerzej umiejscowiony niż zwalidowany wzmacniacz 2, podczas gdy "e18" wykazywał częściowe nakładanie się ze wzmacniaczem 16 (ryc. 5). Wyniki te sugerują, że podejście to z powodzeniem identyfikuje regiony o znanej aktywności regulacyjnej, chociaż szerszy zakres przewidywanych wzmacniaczy może odzwierciedlać elastyczność granic wzmacniaczy. Wzmacniacze często funkcjonują jako elementy modułowe, a ich aktywność może zależeć od kontekstu chromatyny, typu komórki i czasu rozwoju 2,27. W związku z tym przewidywane regiony mogą obejmować podstawowe miejsca aktywne z sąsiednimi sekwencjami, które przyczyniają się do funkcji regulacyjnej, pomimo konieczności walidacji eksperymentalnej w celu określenia, które części tych szerszych prognoz są funkcjonalnie aktywne w kontekście specyficznym dla tkanki lub rozwoju. Podczas gdy VISTA Cardiac Enhancer Browser zidentyfikował cztery regiony w zdefiniowanym zakresie, tylko jeden wzmacniacz, mm370, częściowo pokrywał się z eksperymentalnie potwierdzonym wzmacniaczem, Enhancer 16, szczególnie w regionie oznaczonym przez H3K4me1 (Figura 5)23. Pozostała część mm370, która nie pokrywa się ze Enhancerem 16, może wskazywać na niefunkcjonalny lub nieaktywny podregion wzmacniacza28,29.

Wzmacniacze to niekodujące regiony DNA, które regulują transkrypcję, rozwój i różnicowanie genów 1,2. Mutacje wzmacniaczy mogą prowadzić do różnych chorób, w tym zaburzeń rozwojowych, nowotworów i innych chorób genetycznych 3,4,5,6. Dlatego zrozumienie wzmacniaczy ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia ekspresji genów, mutacji i chorób.
Aby zrozumieć, w jaki sposób wzmacniacze oddziałują z genami docelowymi, ważne jest zidentyfikowanie ich lokalizacji w genomie. Jednak identyfikacja lokalizacji wzmacniaczy nie zawsze jest prosta, ponieważ wzmacniacze mogą znajdować się zarówno blisko miejsca rozpoczęcia transkrypcji (TSS), jak i znacznie dalej, obejmując dziesiątki do setek kilozasad 2,7,8,9.
Pomimo nieprzewidywalnej lokalizacji genomowej, wzmacniacze wykazują wyraźne sygnatury biochemiczne i strukturalne, co pozwala na ich systematyczne śledzenie. Ogólnie rzecz biorąc, wzmacniacze są zwykle wzbogacane w regiony międzygenowe i intronowe, przy czym niewielka liczba znajduje się w eksonach 2,8. Często charakteryzują się specyficznymi modyfikacjami histonów i wiązaniem czynników transkrypcyjnych, które definiują ich role regulacyjne i determinują ich aktywność czasoprzestrzenną na różnych etapach rozwoju i tkankach10,11.
ChIP-seq służy do identyfikacji miejsc wiązania czynnika transkrypcyjnego (TFBS) i znaczników modyfikacji histonów, takich jak cecha charakterystyczna wzmacniaczy, H3K4me1, znaczniki aktywnego wzmacniacza, znaczniki H3K27ac i H3K4me3, które są wzbogacone w regionach promotora 1,12,13,14,15. Techniki wychwytywania konformacji chromatyny (3C) i ich pochodne, takie jak 4C, 5C, Hi-C i ChIA-PET, są wykorzystywane do mapowania fizycznych interakcji między odległymi regionami genomu. Podczas gdy 3C jest ukierunkowany na określone interakcje w określonych tkankach, Hi-C oferuje architekturę obejmującą cały genom we wszystkich typach komórek16,17.
Oprócz obecnych metod opracowano specjalistyczne podejścia do charakterystyki wzmacniaczy, w tym zbiorcze bazy danych wzmacniaczy, takie jak EnhancerAtlas lub EnhancerFinder18,19. Jednak narzędzia te często wymagają od badaczy zintegrowania wielu zestawów danych w celu zbadania wielu wzmacniaczy w wielu tkankach, co może być przytłaczające dla biologów bez doświadczenia w bioinformatyce i eksploracji danych.
Tutaj opisujemy przyjazny dla użytkownika protokół wyboru wzmacniaczy, całkowicie oparty na istniejących narzędziach internetowych. Dzięki temu naukowcy mogą przeszukiwać interesujący nas gen (GoI) i odzyskiwać odpowiednie wzmacniacze. Protokół tutaj wybiera wzmacniacze na podstawie określonego zestawu kryteriów: modyfikacji histonów, interakcji chromatyny i swoistości tkankowej 1,12,13,14,15,16,17,20,21 . Wzmacniacze znajdujące się w intronach z większym prawdopodobieństwem wykazują aktywność specyficzną dla tkanki w porównaniu ze wzmacniaczami międzygenowymi, które są umieszczone w regionach genomu między genami22. Aby zapewnić kompleksowe pokrycie potencjalnych aktywnych wzmacniaczy, zdefiniowaliśmy zakres wyszukiwania między dwoma sąsiadującymi GoI, aby zwiększyć prawdopodobieństwo wychwycenia elementów regulatorowych znajdujących się poza ciałami genów. Użyliśmy epigenetycznej cechy probierczej specyficznej dla wzmacniacza, H3K4me1, i znaku aktywnego wzmacniacza, H3K27ac, aby sporządzić listę kandydatów na wzmacniacze. Kandydaci ci zostali następnie udoskonaleni w oparciu o dane Hi-C, zachowując wzmacniacze z fizycznymi interakcjami z odpowiednim promotorem. Protokół ten ma na celu przeprowadzenie biologów przez proces identyfikacji wzmacniaczy przy użyciu wyłącznie publicznie dostępnych narzędzi internetowych. Integrując dane dotyczące interakcji epigenetycznych i chromatyny, opisane tutaj podejście oferuje praktyczne ramy do generowania hipotez na temat potencjalnych wzmacniaczy do dalszej walidacji eksperymentalnej.

<table><tbody><tr><td>Stanowisko komputerowe</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Komputer z obsługą przeglądarki internetowej, system operacyjny Windows/Mac/Linux</td></tr><tr><td>Portal danych 4DN</td><td>Portal danych 4DN</td><td>https://data.4dnucleome.org/</td><td></td></tr><tr><td>Galaktyka</td><td>Galaktyka</td><td>https://usegalaxy.org/published/history?id=aff5db4e07064445</td><td></td></tr><tr><td>Serwis Github</td><td>Serwis Github</td><td>https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow</td><td></td></tr><tr><td>VISTA&nbsp;</td><td>Przeglądarka VISTA Cardiac Enhancer</td><td>https://portal.nersc.gov/dna/RD/heart/</td><td></td></tr></tbody></table>

internetowy przepływ pracy do wyboru wzmacniaczy specyficznych dla genów i tkanek

A Web-Based Workflow for Selecting Gene- and Tissue-Specific Enhancers

Wzmacniacze to regiony DNA, które regulują ekspresję genów. Mutacje w wzmacniaczach mogą powodować nieprawidłową regulację genów prowadzącą do choroby. Dlatego identyfikacja wzmacniaczy, które regulują aktywność genów w określonych tkankach, ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia genetycznych podstaw choroby. Jednak wzmacniacze są trudne do zidentyfikowania, ponieważ nie kodują białek. Chociaż dostępnych jest wiele repozytoriów wzmacniaczy i narzędzi identyfikacyjnych, złożoność tych narzędzi może stanowić wyzwanie dla biologów. Aby ułatwić biologom korzystanie z tych zasobów, przedstawiamy przyjazny dla biologów protokół (https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow), który wykorzystuje istniejące dane genomiczne oparte na Internecie, takie jak znaczniki histonów H3K4me1 i H3K27ac oraz dane z analizy konformacji chromatyny (Hi-C), aby odkryć wzmacniacze związane z genem będącym przedmiotem zainteresowania (GoI) w tkance docelowej, w której wzmacniacz jest aktywny. Protokół ten jest całkowicie oparty na sieci Web i nie wymaga od użytkowników końcowych umiejętności programowania. Wykazaliśmy użyteczność tego podejścia, charakteryzując potencjalne wzmacniacze regulujące TBX5, gen krytyczny dla rozwoju serca. Protokół ten ułatwia identyfikację wzmacniaczy związanych z tym genem w lewej komorze.

Aby zilustrować zastosowanie przedstawionego protokołu, zbadaliśmy gen TBX5 w ludzkim sercu, badając wzmacniacze związane z TBX5 przy użyciu kompleksowego przepływu pracy obejmującego dane H3K4me1, H3K27ac i Hi-C. TBX5 to gen, który przyczynia się do rozwoju kończyn i serca, w tym do tworzenia czterech komór i separacji przegrody24. Mutacja w tym genie jest główną przyczyną zespołu Holta-Orama (HOS), który powoduje nieprawidłowości kończyn i wrodzone wady serca (CHD), w tym ubytki przegrody24. Mutacja wzmacniaczy serca związanych z TBX5 może krytycznie wpływać na CHD24. Poprzednie badanie odkryło trzy znane wzmacniacze TBX5 w ludzkiej tkance specyficznej dla serca - a mianowicie "Enhancer 2", "Enhancer 9" i "Enhancer 16" (Supplementary File 2), które, jak wykazano, mają porównywalne fenotypy u myszy transgenicznych23.
Zbadaliśmy regiony wzbogacone w H3K4me1 i H3K27ac między RBM19 i TBX3, które są dwoma genami flankującymi za i przed TBX5 u człowieka, w celu odzyskania przypuszczalnych wzmacniaczy w locus TBX5 (Figura 1 i Figura 2). Aby zidentyfikować wzmacniacze specyficzne dla serca, wybrano komórki mięśnia sercowego. Przypuszczalne regiony wzmacniacza serca TBX5 zostały pobrane jako współrzędne (chr12: początek-koniec) i zidentyfikowano 22 regiony związane z H3K4me1 i H3K27ac (ryc. 3 i plik uzupełniający 3). Przypuszczalne wzmacniacze serca TBX5 pobrano z genomowej bazy danych EnsEMBL w celu porównania danych Hi-C przechowywanych w bazie danych 4DNucleome (Figura 4). Dokonano tego, aby ocenić możliwe interakcje między potencjalnymi wzmacniaczami a promotorem serca TBX5 . Zgodnie z opisanym tutaj protokołem potwierdzono, że 21 z 22 regionów genomu wchodzi w interakcję z promotorem TBX5 (chr12: 114400143-114410103) w komórkach mięśnia sercowego (plik uzupełniający 4). Był jeden region, który nie miał fizycznej interakcji z promotorem (Rysunek 4, krok 4.8). Na koniec porównaliśmy ten protokół z tymi biologicznie zwalidowanymi wzmacniaczami i obecną złotym standardem bazy danych wzmacniaczy serca, VISTA Cardiac Enhancers Browser, i ujawniliśmy dodatkowe wzmacniacze, które nie są obecnie rejestrowane w bazie danych25.
Przeprowadziliśmy porównanie krzyżowe 21 wzmacniaczy TBX5 pobranych przez przedstawiony tutaj protokół z istniejącymi bazami danych. Pobraliśmy 4 wzmacniacze TBX5 z przeglądarki VISTA Cardiac Enhancer Browser (plik uzupełniający 5)25. Spośród 4 wzmacniaczy serca zidentyfikowanych przez VISTA, 3 wzmacniacze, hs2329, mm1282 i m370 pokrywały się z regionami zidentyfikowanymi przez ten internetowy protokół wykrywania wzmacniaczy (ryc. 5). Każdy z przewidywanych wzmacniaczy dzielił również regiony genomu z wcześniej eksperymentalnie zwalidowanymi wzmacniaczami z Smemo i wsp.23, Enhancer 2 (chr12:114025907-114026275, GRCh38) i Enhancer 16 (chr12:114415466-114420433, GRCh38), podczas gdy nie wykazywały one pokrywania się z Enhancer 9 (chr12:114263402-114266886, GRCh38). Jeden z wzmacniaczy zidentyfikowanych przez VISTA, hs498 nie pokrywał się z żadnymi przewidywanymi wzmacniaczami przez ten protokół lub eksperymentalnie zwalidowane wzmacniacze Smemo i wsp.23 (Figura 5), mimo że region wykazywał częściowe nakładanie się ze znacznikami H34Kme1 (Figura 5). Podobnie, Enhancer 9 nie pokrywał się z przewidywanymi wzmacniaczami przez ten potok, ale był związany ze znacznikami H3K4me1 (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66840/66840fig1.jpg"> 
Rysunek 1: Przewodnik krok po kroku, jak zlokalizować GoI w przeglądarce genomu EnsEMBL. Użytkownik najpierw otwiera stronę główną EnsEMBL (1.1), wybiera gatunek (Człowiek) i wpisuje gen w pasku wyszukiwania (1.2-1.3). Z listy wyników wybierany jest odpowiedni identyfikator genu (1.4), co powoduje otwarcie strony podsumowania genu. Następnie użytkownik klika hiperłącze Region w szczegółach (1.5), aby zwizualizować region genomu otaczający rząd Indii, w tym sąsiednie elementy i cechy regulacyjne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/66840fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66840/66840fig2.jpg"> 
Rysunek 2: Definiowanie regionu wykrywania wzmacniacza wokół GoI za pomocą przeglądarki genomu EnsEMBL. Aby zdefiniować region wykrywania wzmacniacza, zidentyfikuj dwa sąsiednie geny otaczające GoI za pomocą podstawowych adnotacji genów ze ścieżki GENCODE , gdzie geny są pokazane jako ciemnożółte bloki oznaczone połączonymi adnotacjami EnsEMBL / Havana. Kierunek transkrypcji każdego genu jest wskazywany przez groty strzałek (&lt; lub &gt;) obok nazwy genu (2.1). Aby wybrać region międzygenowy między sąsiednimi genami, kliknij i przeciągnij w poprzek obszaru zainteresowania, a następnie wybierz opcję Przejdź do regionu w wyskakującym okienku, aby powiększyć (2.2). Aby dodać adnotacje związane z regulacjami lub ulepszaczem, kliknij przycisk Dodaj/usuń ścieżki (2.3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/66840fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66840/66840fig3v2.jpg"> 
Rysunek 3: Konfiguracja ścieżek modyfikacji histonów w regionie wykrywania wzmacniacza za pomocą przeglądarki genomu EnsEMBL. Na lewym pasku narzędzi kliknij Konfiguruj tę stronę (3.1), aby uzyskać dostęp do panelu konfiguracji ścieżki i przejdź do sekcji "Aktywność według komórki/tkanki" w sekcji Regulacja (3.2). W otwartej zakładce wybierz sekcję "Eksperymenty" (3.3) i użyj paska wyszukiwania Komórka/Tkanka, aby zlokalizować i wybrać interesującą Cię tkankę (komórkę mięśnia sercowego) (3.4). W panelu znaczników histonów (3.5) włącz H3K4me1 i H3K27ac jako aktywne znaczniki wzmacniające oraz H3K4me3 jako znacznik promotora, a następnie kliknij "Konfiguruj wyświetlanie ścieżki" (3.6). Po potwierdzeniu wyboru ścieżek kliknij "Wyświetl ślady" (3.7), aby powrócić do przeglądarki genomu. Piki znacznika histonowego są teraz pokazane w obszarze detekcji (3.8) jako kolorowe bloki pod odpowiednią etykietą tkankową (żółty: H3K4me1, niebieski: H3K27ac i pomarańczowy: H3K4me3). Wyskakujące okienko "Hists &amp; Pols" zawierające współrzędne genomowe regionu w parach zasad (chr:start-end), które można skopiować i zapisać do dalszej analizy. Wyskakujące okienko "Hists &amp; Pols" pojawia się po kliknięciu na kolorowe elementy na ścieżce. Wyskakujące okienko zawiera współrzędne genomowe regionu w parach zasad (np. chr12:11443450-114451611 dla regionu promotora), które można skopiować i zapisać do dalszej analizy (3.8). Podobnie, aby wyodrębnić potencjalne wzmacniacze, nadaj priorytet regionom, w których piki H3K4me1 i H3K27ac nakładają się na siebie, jak pokazano w pionowym wyrównaniu szczytów i pól na ścieżkach (3.9). Nakładające się regiony można wybrać bezpośrednio, klikając ich pola lub ręcznie przeciągając po wyrównanych szczytach w celu zdefiniowania regionu (np. chr12:114400143-114410103 dla aktywnego regionu kandydującego). Współrzędne wyświetlane w oknie podręcznym powinny być zapisane w formacie BED w celu dalszej walidacji lub wizualizacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/66840fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66840/66840fig4v2.jpg"> 
Rysunek 4: Wizualizacja oddziaływań chromatyny promotor-wzmacniacz przy użyciu map cieplnych Hi-C z portalu 4D Nucleome Data Portal. Strona główna 4D Nucleome Data Portal wyświetla skumulowany wykres słupkowy podsumowujący dostępne typy eksperymentów według organizmu. Zbiór danych "in situ Hi-C" dla próbek pobranych przez ludzi wybiera się, klikając odpowiednią sekcję paska (4.1). Zostanie wyświetlona przefiltrowana lista odpowiednich zestawów danych; wybiera się zestaw danych Hi-C pochodzący z komórek H9 zróżnicowanych w mioblasty serca (4.2). Wybrany zestaw danych (4.3) jest otwierany w przeglądarce HiGlass za pomocą przycisku Eksploruj dane (4.4). Interesujący obszar genomu jest wprowadzany w polu współrzędnych (4.5), a macierz kontaktowa jest renderowana jako mapa cieplna ze skalą kolorów. Ciemniejsze kolory (od głębokiej czerwieni do czerni) wskazują na silniejszą częstotliwość kontaktu chromatyny, podczas gdy jaśniejsze kolory (od białego do pomarańczowego) reprezentują słabsze interakcje. Reguła pozioma jest umieszczana na współrzędnej promotora, a reguły pionowe są rysowane na pozycjach trzech eksperymentalnie potwierdzonych wzmacniaczy kontrolnych (4.6). Przecięcia te są używane do zdefiniowania ścisłego progu oddziaływania, wyznaczonego przez najsilniejszy sygnał widzialny (najciemniejszy kolor) wśród styków promotor-wzmacniacz (4.7). Dodatkowe linie pionowe są rysowane w lokalizacjach kandydujących wzmacniaczy oznaczonych H3K27ac i H3K4me1 (od kroku 3.8). Kandydaci, których przecięcia promotora-wzmacniacza są równe lub ciemniejsze od progu, są zatrzymywani, podczas gdy ci ze słabszymi sygnałami (jaśniejsze kwadraty kolorów) są wykluczani (4,8). Zachowane współrzędne są wyodrębniane ręcznie i zapisywane w formacie BED do dalszych analiz. (a. Wzmacniacz 2, b. Wzmacniacz 9 i c. Wzmacniacz 16) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/66840fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66840/66840fig5.jpg"> 
Rycina 5: Widok przeglądarki genomowej przewidywanych wzmacniaczy TBX5 w porównaniu z zatwierdzonymi przez VISTA wzmacniaczami serca i wzmacniaczami kontroli. Migawki przeglądarki genomu wyświetlają zakres wyszukiwania wzmacniacza (KROK 2), porównując przewidywane wzmacniacze pobrane przez protokół internetowy (na dole) ze wzmacniaczami zwalidowanymi przez VISTA (u góry) i eksperymentalnie zwalidowanymi wzmacniaczami kontrolnymi (w środku). Główny panel pokazuje pełne locus genomowe z adnotacjami dotyczącymi elementów regulatorowych, w tym piki H3K4me1 specyficzne dla komórek mięśnia sercowego (żółty), H3K27ac (niebieski) i H3K4me3 (pomarańczowy). Trzy powiększone rysunki pokazują wyrównanie między wzmacniaczami pobranymi przez protokół, VISTA i kontrolnymi. Nakładanie się na wzmacniacze kontroli jest oznaczone czerwonymi ramkami. Współrzędne każdego podregionu są wyświetlane w dolnych panelach przeglądarki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/66840fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Dane wykorzystane w badaniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Narzędzia internetowe wykorzystane w badaniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Table%202.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Plik uzupełniający 1: Instrukcje rozwiązywania problemów z przeglądarką genomu EnsEMBL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: Plik BED w formacie GRCh38, eksperymentalnie zwalidowane wzmacniacze kontroli serca TBX5 23. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Supplementary%20File%202.bed" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 3: Plik BED w formacie GRCh38, wzmacniacze serca TBX5 pobrane przez STEP3 z EnsEMBL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Supplementary%20File%203.bed" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 4: Plik BED w formacie GRCh38, wzmacniacze serca TBX5 pobrane przez STEP4 z EnsEMBL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Supplementary%20File%204.bed" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 5: Plik BED w formacie GRCh38, wzmacniacze serca TBX5 pobrane z przeglądarki VISTA cardiac enhancer25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Supplementary%20File%205.bed" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Przedstawiamy niewymagający kodowania przepływ pracy dla biologów w celu identyfikacji specyficznych tkankowo wzmacniaczy genów przy użyciu wyłącznie narzędzi opartych na przeglądarce. Nasz protokół wykorzystuje publiczne znaczniki histonowe H3K4me1/H3K27ac i dane Hi-C, umożliwiając naukowcom bez doświadczenia w programowaniu dostęp, analizę i identyfikację potencjalnych elementów regulacyjnych związanych z ich interesującymi genami.

Internetowy przepływ pracy do wyboru wzmacniaczy specyficznych dla genów i tkanek

Enhancers are DNA regions that regulate gene expression. Mutations within enhancers can result in abnormal gene regulation leading to disease. Therefore, ...

Jesteśmy zainteresowani dekodowaniem genomu niekodującego, aby zrozumieć, w jaki sposób geny są regulowane, aby ulegały ekspresji we właściwym czasie i miejscu. Opracowujemy przyjazne dla użytkownika protokoły przy użyciu internetowych narzędzi genomicznych, aby ułatwić wszystkim biologom dostęp do rozszerzonych odkryć. Szeroka dostępność danych multimodalnych, które mogą pomóc w zawężeniu lokalizacji wzmacniaczy i łatwym dostępie do tych danych za pośrednictwem interfejsów internetowych typu open source.Umożliwia to kompleksową identyfikację wzmacniaczy bez konieczności posiadania specjalistycznej wiedzy programistycznej ze strony badaczy. Protokół ten stanowi podstawę dla każdego, kto nie ma doświadczenia w biologii wzmacniaczy, aby rozpocząć poruszanie się po publicznie dostępnych zestawach danych w celu odzyskania wzmacniaczy dla interesujących genów. Jako studium przypadku używamy TBX5, znanego gracza w biologii serca.Nasz przepływ pracy zidentyfikował 21 wzmacniaczy, które mogą rzucić światło na mechanizmy rozwoju serca i wrodzone wady serca. Rozszerzymy nasz protokół o nowe źródła danych, w tym genomikę przestrzenną, jednocześnie opracowując dodatkowe narzędzia przyjazne dla użytkownika dla biologów. Aby rozpocząć, otwórz przeglądarkę Ensembl Genome.Wybierz zestaw genomu, który pasuje do gatunku i wersji zainteresowania. Wprowadź interesujący Cię gen w polu wyszukiwania i kliknij Przejdź.Z wyników kliknij odpowiedni identyfikator genu Ensembl.Następnie przewiń do Podsumowanie"sekcji i kliknij Region w szczegółach"link, aby zwizualizować otaczający region interesującego genu. Teraz poszukaj dwóch genów otaczających gen będący przedmiotem zainteresowania, korzystając ze ścieżki Gene Legend.Geny te pojawiają się jako elementy wizualne reprezentujące połączone adnotacje Ensembl i Havana w podstawowych adnotacjach genów ze ścieżki GENCODE. Określ kierunkowość interesującego genu, obserwując znaki większe niż lub mniejsze niż obok nazw genów. Kliknij i przeciągnij kursor przez region międzygenowy między tymi genami, a następnie kliknij Skocz do regionu"w wyskakującym okienku, aby wyświetlić wybrany region.Dostosuj wyświetlanie, klikając Dodaj"lub Usuń ścieżki"u góry przeglądarki ścieżek. Użyj elementów sterujących powiększeniem i nawigacją, aby dostosować widok w celu uzyskania ulepszonej wizualizacji regionu. W szczegółach regionu"przeglądarka zakładek, kliknij Konfiguruj tę stronę"na pasku bocznym.Na pasku bocznym Konfiguruj obraz regionu, w obszarze Regulacja, wybierz opcję Aktywność według komórki lub tkanki. Użyj paska wyszukiwania komórek lub tkanek, aby znaleźć i wybrać żądane tkanki, lub użyj indeksu alfabetycznego poniżej paska. Kliknij na Eksperymenty"zakładka obok Komórka lub Tkanka"opcja.Wybierz H3K4me1 i H3K27ac jako znacznik dla wzmacniaczy oraz H3K4me3 jako znacznik dla promotorów i kliknij Konfiguruj wyświetlanie ścieżek. Następnie wybierz Wyświetl ścieżki", aby wyświetlić regiony oznaczone przez H3K4me1 w regionie wykrywania wzmacniacza i regiony oznaczone przez H3K4me3 przed genem będącym przedmiotem zainteresowania. Kliknij kolorowe elementy wizualne lub pudełkowe na ścieżce H3K4me1, aby pobrać współrzędne genomowe regionów oznaczonych w zdefiniowanym regionie wykrywania.Spowoduje to otwarcie wyskakującego okienka Hists i Pols, które wyświetla lokalizację genomową pierwiastka w parach zasad. Alternatywnie można ręcznie zdefiniować obszary zainteresowania dla każdej cechy genomowej, klikając i przeciągając ścieżkę, aby umieścić piki grafu pod ścieżkami H3K4me1 lub H3K27ac. Następnie skopiuj współrzędne lokalizacji genomu do pliku tekstowego i zapisz plik w formacie BED.Uzyskaj dostęp do portalu danych 4DN. Na stronie głównej upewnij się, że Zestawy eksperymentów "jest wybrane jako oś Y głównego słupka skumulowanego, Typ eksperymentu" jest wybrane jako oś X, a wykres jest pogrupowany według organizmu. Zlokalizuj pasek In Situ Hi-C wzdłuż osi X i kliknij część reprezentującą zestawy eksperymentów na ludziach.W wyskakującym okienku kliknij Przeglądaj"przycisk i wybierz mioblasty mięśnia sercowego"i nasz interesujący nas gen, TBX5, związany z organogenezą serca. Kliknij link w kolumnie "Tytuł" odpowiedniej próbki biologicznej odpowiadającej interesującej tkance. Następnie w zakładce Przetworzone pliki kliknij Eksploruj dane", aby bardziej szczegółowo przyjrzeć się zestawowi danych Hi-C.Wprowadź współrzędne zidentyfikowanego promotora w interesującej tkance i kliknij prawym przyciskiem myszy mapę cieplną, aby oznaczyć region w poziomie. Linie te umożliwiają wizualne śledzenie regionu promotora na mapie cieplnej. W razie potrzeby dostosuj widok, przeciągając go w pionie, aż górna i dolna granica współrzędnych Y paska wyszukiwania zrównają się z granicami obszaru zainteresowania.Aby usunąć niechciane linie, kliknij linię prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Pozioma" lub Reguła pionowa, a następnie kliknij polecenie Zamknij serię. Wprowadź współrzędne wszystkich zwalidowanych eksperymentalnie wzmacniaczy kontrolnych, aby obliczyć próg interakcji na podstawie ich minimalnych wartości interakcji. Wyświetl trzy wzmacniacze kontrolne z literatury wraz z regionem promotora z Ensembl, korzystając z wcześniej przygotowanego widoku.Następnie zdefiniuj próg wzmacniacza promotora przy użyciu tych wzmacniaczy kontrolnych, wybierając najniższy niezerowy wynik interakcji, jak wskazuje klucz koloru po prawej stronie macierzy mapy cieplnej. Wprowadź współrzędne genomowe wszystkich regionów wzmacniacza związanych z H3K4me1 i zaznacz je pionowo na mapie cieplnej Hi-C. Odfiltruj słabo oddziałujące regiony, porównując wyniki interakcji regionów oznaczonych H3K4me3 z progiem interakcji.Wybierz współrzędne genomowe pokazujące częstości interakcji powyżej tego progu, które pojawiają się jako bardziej skoncentrowane lub ciemniejsze sygnały na mapie cieplnej, i zapisz je w formacie BED. Trzy z czterech wzmacniaczy serca zidentyfikowanych w przeglądarce VISTA Cardiac Enhancer Browser, HS2329, mm1282 i mm370, pokrywały się z regionami przewidywanymi przez internetowy protokół wykrywania wzmacniaczy. Enhancer Two pokrywał się zarówno z regionem przewidzianym przez protokół wykrywania wzmacniacza, jak i eksperymentalnie zwalidowanym wzmacniaczem.Enhancer 16 wykazywał pokrywanie się zarówno z przewidywanymi regionami wzmacniacza, jak i wcześniejszymi danymi eksperymentalnymi. Enhancer Nine nie pokrywał się z żadnymi przewidywanymi wzmacniaczami z rurociągu, ale wykazał częściowe wzbogacenie sygnału H3K4me1.

a-web-based-workflow-for-selecting-gene-and-tissue-specific-enhancers

Research

JoVE Journal

Genetics

W tej pracy zapewniamy eksperymentalny przepływ pracy, w jaki sposób aktywne wzmacniacze mogą być identyfikowane i eksperymentalnie weryfikowane.

Przewidywanie i walidacja elementów regulatorowych genów aktywowanych podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych indukowanego kwasem retinowym

W przeciwieństwie do danych o sekwencjach DNA, dane epigenomiczne nie są łatwo poddawane wyszukiwaniom tekstowym. Poniżej przedstawiono procedury korzystania z ulepszonej wersji GeNemo, internetowego narzędzia bioinformatycznego, do przeprowadzania opartych na wzorcach poszukiwań podobieństw w danych epigenomicznych, porównując dostępne internetowe bazy danych, w tym Encyklopedię Elementów DNA, z danymi użytkownika.

Wyszukiwanie danych epigenomicznych w oparciu o wzorce za pomocą GeNemo

Ten protokół opisuje kroki potrzebne do zaprojektowania i przeprowadzenia multipleksowanego celowania wzmacniaczy za pomocą dezaktywującego białka fuzyjnego SID4X-dCas9-KRAB, znanego również jako interferencja wzmacniacza (Enhancer-i). Protokół ten umożliwia identyfikację wzmacniaczy, które regulują ekspresję genów i ułatwia analizę relacji między wzmacniaczami regulującymi wspólny gen docelowy.

Analiza funkcji wzmacniacza za pomocą interferencji wzmacniacza opartego na multipleksie CRISPR w liniach komórkowych

Ten protokół przedstawia kroki potrzebne do wygenerowania modelowego systemu, w którym transkrypcja interesującego nas endogennego genu może być warunkowo kontrolowana u żywych zwierząt lub komórek za pomocą ulepszonych systemów represora lac i/lub aktywatora tet.

Zastosowanie in vivo systemu REMOTE-control do manipulacji endogenną ekspresją genów

Informujemy o zastosowaniu ilościowego wychwytywania konformacji chromosomów, a następnie sekwencjonowania wysokoprzepustowego w ciałach embrionalnych generowanych z embrionalnych komórek macierzystych. Technika ta pozwala na identyfikację i ilościowe określenie kontaktów między domniemanymi wzmacniaczami a regionami promotorowymi danego genu podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych.

Identyfikacja kontaktów wzmacniacz-promotor w ciałach embrionalnych poprzez ilościowe wychwytywanie konformacji chromosomów (4C)

Ten protokół opisuje nowatorski test przejściowy oparty na rAAV z funkcją wzmacniania i opisywania. Ten test może być wykorzystany do wywołania ekspresji in vivo w mózgu myszy.

Wdrożenie AAV konstruktów ekspresyjnych opartych na wzmacniaczu in vivo w mózgu myszy

Tutaj prezentujemy protokół selekcji in vitro zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych (ETR) o wysokiej, długoterminowej, stabilnej skuteczności wyciszania na miejscu i niskiej aktywności w całym genomie, poza celem. Taki przepływ pracy pozwala na zredukowanie początkowego, złożonego repertuaru potencjalnych ETR do krótkiej listy, nadającej się do dalszej oceny w odpowiednich terapeutycznie warunkach.

In vitro Wybór zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych do ukierunkowanego wyciszania epigenetycznego

Ekspresja genów jest regulowana przez interakcje promotorów genów z dystalnymi elementami regulatorowymi. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób niski poziom wejściowy Capture Hi-C (liCHi-C) pozwala na identyfikację tych interakcji w rzadkich typach komórek, które wcześniej były niemierzalne.

Zintegrowany proces pracy do badania architektury genomu czasoprzestrzennego skoncentrowanej na promotorze w rzadkich populacjach komórek

Protokół ten zapewnia uproszczony proces obliczeniowy do ilościowej identyfikacji początkujących transkrypcji wzmacniaczy. Integrując dostępność chromatyny, cechy chromatyny oraz dane transkrypcyjne, umożliwia dokładne wykrywanie i analizę aktywności wzmacniacza specyficzną dla nici w złożonych regionach intragenowych, pozostając jednocześnie dostępnym dla badaczy bez rozległego szkolenia bioinformatycznego.

Tok obliczeniowy do ilościowej identyfikacji RNA intergenowego/wewnątrzgenowego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Opisujemy metodę sortowania pojedynczych komórek ssaków i ilościowego określania ekspresji do 96 docelowych genów w każdej komórce. Metoda ta obejmuje wykorzystanie wewnętrznych wzorców qPCR w celu umożliwienia oszacowania bezwzględnej liczby transkryptów.

Profilowanie ekspresji genów w pojedynczej komórce za pomocą FACS i qPCR z wewnętrznymi standardami

Poznaj metodę identyfikacji wzmacniaczy specyficznych dla tkanek bez kodowania, wykorzystującą dane histonowe H3K4me1, H3K27ac oraz Hi-C. Protokół oparty na przeglądarce Ensembl umożliwia biologom odkrywanie elementów regulacyjnych związanych z genami, takimi jak TBX5.

Internetowy przepływ pracy do wyboru wzmacniaczy specyficznych dla genów i tkanek

Przeglądaj więcej filmów