Name: Wykrywanie autoprzeciwciał anty-MDA5 za pomocą komórek HeLa oraz immunocytochemii za pomocą mikroskopii świetlnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-31T14:05:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Poznaj metodę immunocytochemii do wykrywania autoprzeciwciał anty-MDA5 przy użyciu komórek HeLa. Ta technika umożliwia szybszą i bardziej ekonomiczną diagnostykę mięśniaków związanych z chorobami płuc.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez granty Tajwańskiej Narodowej Rady Nauki i Technologii przyznane Jye-Lin Hsu (NSTC 114-2320-B-039-038 oraz NSTC 113-2320-B-039-032). Badanie to było również częściowo wspierane przez granty Chińskiego Uniwersytetu Medycznego i szpitala przyznane Jye-Lin Hsu (CMU113-MF-89 oraz C1110812016-12).

1. Hodowla komórkowa i transfekcja
<ol>
	<li>Utrzymuj komórki HeLa za pomocą Zmodyfikowanego Medium Eagle Dulbecco zawierającego 10% surowicy płodowej bydła (FBS) i 1% antymikotyku antymikotycznego w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze 5%CO2 .</li>
	<li>Usuwaj komórki co 2-3 dni lub gdy komórki osiągną łączność 90%-100%.</li>
	<li>Nasiono 7 × 10 4komórek HeLa w każdej dołku na 24-dołkownicowej płytce (1,9 cm2/dołek) 24 godziny przed transfekcją, aby komórki osiągnęły około 90% zbieżności.</li>
	<li>Rozcieńcz 500 ng plazmidu (pENTER-MDA5) oraz 1,5 μL odczynnika transfekcyjnego każdy w 25 μL zredukowanego medium surowicowego.</li>
	<li>Dodaj rozcieńczone DNA do rozcieńczonego odczynnika transfekcyjnego (stosunek 1:1). Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 5 minut.</li>
	<li>Dodaj mieszankę do komórek zasianych dzień wcześniej i natychmiast mieszaj, aby wymieszać kompleks DNA-lipidowy. Potwierdź, że komórki są łączne w 80%-90%.</li>
	<li>Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze 5% CO2 przez 24 godziny, a następnie wykonuj ICC. UWAGA: Użyliśmy komercyjnie dostępnego wektora (pEnter-MDA5); więcej informacji można znaleźć w Tabeli Materiałów. Skuteczność transfekcji wynosi ~50%. Skuteczność transfekcji i ekspresji docelowego białka można określić, transfekując komórki plazmidem ekspresyjnym fluorescencyjnym oraz przeprowadzając western blot w celu wizualizacji ekspresji docelowego białka.</li>
</ol>
2. Utrwalanie komórek
<ol>
	<li>Po inkubacji przemyj komórki 2 razy PBS, aby usunąć pozostałe nośniki. UWAGA: Mycie można wykonać poprzez potrząsanie płytą na wstrząsance orbitalnej.</li>
	<li>Utrwal komórki w 4% paradehydu w PBS. Zostaw ogniwa na 15 minut w temperaturze pokojowej. UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny. Stosuj odpowiednie zasady postępowania.</li>
	<li>Aspiruj odczynnik utrwalający i użyj PBS do przemycia komórek 2 razy.</li>
</ol>
3. Permeabilizacja komórek
<ol>
	<li>Dodaj odczynnik Triton X-100 (0,3% w PBS) i pozwól komórkom odczekać 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po 10 minutach wyrzuć detergent.</li>
	<li>Dodaj PBS do przeprania komórek raz.</li>
</ol>
4. Blokowanie komórek
<ol>
	<li>Wykonaj blokowanie z 10% surowicy płodowej bydła w PBS (1x) i inkubuj komórki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń odczynnik blokujący, a następnie dodaj PBS, aby raz przepłukać komórki.</li>
</ol>
5. Hybrydyzacja przeciwciał pacjenta
<ol>
	<li>Dodaj rozcieńczone osocze pacjenta do komórek. Przed użyciem pamiętaj, aby rozcieńczyć próbkę pacjenta (rozcieńczenie 1:5 000 w PBS) w PBS. UWAGA: Dostosuj rozcieńczenie, aby wzmocnić sygnał lub zmniejszyć tło w razie potrzeby. Aby zapewnić obiektywne wyniki, personel przeprowadzający testy nie miał wiedzy, które próbki należały do pacjentów, a które od zdrowych osób.</li>
	<li>Inkubuj próbkę w temperaturze 4 °C przez 12-16 godzin (przez noc).</li>
	<li>Po upływie okresu inkubacji pobierz próbkę pacjenta i przemyj komórki 3 razy PBS.</li>
</ol>
6. Hybrydyzacja przeciwciał wtórnych
<ol>
	<li>Należ na komórki poddać rozcieńczony IgG kozi antyludzki z nadoksydazą chrzanową (rozcieńczenie 1:250 w PBS) i pozostawić komórki na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Godzinę później pozbądź się przeciwciał wtórnych.</li>
	<li>Przepłucz PBS 3x.</li>
</ol>
7. Barwienie komórkowe
<ol>
	<li>Po umyciu komórek barw je 300 μL roztworu roboczego DAB. UWAGA: Roztwór ten został przygotowany przez zmieszanie koncentratu chromogenu DAB i rozcieńczalnika DAB zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Po 5 minutach barwienia komórek usuń barwnik, opłuknij wodą destylowaną i potrząsaj przez 5 minut.</li>
</ol>
8. Kontrastkolorowanie komórkowe
<ol>
	<li>Przeciwbarwienie jądra komórkowego rozcieńczoną hematoksyliną. UWAGA: Stosujemy hematoksylinę Gill II w 10-krotnym rozcieńczeniu i czekamy 5 minut na proces barwienia.</li>
	<li>Po 5 minutach wyrzuć hematoksylinę, a następnie przepłucz ją dezynzistowaną wodą destylowaną przez 2 x 5 minut.</li>
</ol>
9. Obserwacja
<ol>
	<li>Obserwuj efekty barwienia za pomocą mikroskopu optycznego. UWAGA: Prawdziwy pozytywny wynik wykazuje silne brązowe barwienie wewnątrz komórek HeLa ekspresujących MDA5; potwierdza to obecność autoprzeciwciał anty-MDA5 w próbce pacjenta. Wynik negatywny pokazuje komórki HeLa bez brązowego przebarwienia, co wskazuje na brak autoprzeciwciał przeciw MDA5. Wynik fałszywie pozytywny wykazuje rozległe brązowe przebarwienia we wszystkich komórkach, niezależnie od ekspresji MDA5. To niespecyficzne zabarwienie, występujące w innych chorobach autoimmunologicznych, musi być odróżnione od prawdziwie pozytywnego, aby uniknąć błędnej diagnozy.</li>
</ol>

<ol><li>Mehta, P., Machado, P. M., Gupta, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+and+managing+anti-MDA5+dermatomyositis%2C+including+potential+COVID-19+mimicry%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatol+Int%22%5BJournal%5D)">Understanding and managing anti-MDA5 dermatomyositis, including potential COVID-19 mimicry.</a> Rheumatol Int. 41 (6), 1021-1036 (2021).</li>
<li>Tansley, S. L., McHugh, N. J., Wedderburn, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+and+juvenile+dermatomyositis%3A+are+the+distinct+clinical+features+explained+by+our+current+understanding+of+serological+subgroups+and+pathogenic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Adult and juvenile dermatomyositis: are the distinct clinical features explained by our current understanding of serological subgroups and pathogenic mechanisms.</a> Arthritis Res Ther. 15 (2), 211(2013).</li>
<li>Fujisawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+myositis-associated+interstitial+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Medicina%22%5BJournal%5D)">Management of myositis-associated interstitial lung disease.</a> Medicina. 57 (4), 347(2021).</li>
<li>Sasaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+initiation+of+plasma+exchange+therapy+for+a+patient+with+anti-MDA5+autoantibody-positive+dermatomyositis+developing+rapidly+progressive+interstitial+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Rheumatol+Case+Rep%22%5BJournal%5D)">Early initiation of plasma exchange therapy for a patient with anti-MDA5 autoantibody-positive dermatomyositis developing rapidly progressive interstitial lung disease.</a> Mod Rheumatol Case Rep. 5 (1), 87-92 (2021).</li>
<li>Go, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+benefit+associated+with+early+cyclosporine+treatment+for+dermatomyositis-associated+interstitial+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatol+Int%22%5BJournal%5D)">Survival benefit associated with early cyclosporine treatment for dermatomyositis-associated interstitial lung disease.</a> Rheumatol Int. 36 (2), 125-132 (2015).</li>
<li>Tsuji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+prospective+study+of+the+efficacy+and+safety+of+combined+immunosuppressive+therapy+with+high-dose+glucocorticoid%2C+tacrolimus%2C+and+cyclophosphamide+in+interstitial+lung+diseases+accompanied+by+anti-melanoma+differentiation-associated+gene+5-positive+dermatomyositis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Multicenter prospective study of the efficacy and safety of combined immunosuppressive therapy with high-dose glucocorticoid, tacrolimus, and cyclophosphamide in interstitial lung diseases accompanied by anti-melanoma differentiation-associated gene 5-positive dermatomyositis.</a> Arthritis Rheumatol. 72 (3), 488-498 (2020).</li>
<li>Hozumi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+assessment+of+myositis-specific+autoantibodies+in+polymyositis%2Fdermatomyositis-associated+interstitial+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Med%22%5BJournal%5D)">Comprehensive assessment of myositis-specific autoantibodies in polymyositis/dermatomyositis-associated interstitial lung disease.</a> Respir Med. 122, 1-8 (2016).</li>
<li>Nakashima, R., Hosono, Y., Mimori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+and+new+detection+system+of+autoantibodies+in+myositis+with+interstitial+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lupus%22%5BJournal%5D)">Clinical significance and new detection system of autoantibodies in myositis with interstitial lung disease.</a> Lupus. 25 (8), 925-933 (2016).</li>
<li>Koga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnostic+utility+of+anti-melanoma+differentiation-associated+gene+5+antibody+testing+for+predicting+the+prognosis+of+Japanese+patients+with+DM%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology%22%5BJournal%5D)">The diagnostic utility of anti-melanoma differentiation-associated gene 5 antibody testing for predicting the prognosis of Japanese patients with DM.</a> Rheumatology. 51 (7), 1278-1284 (2012).</li>
<li>Fuzzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-MDA5+dermatomyositis%3A+an+update+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Anti-MDA5 dermatomyositis: an update from bench to bedside.</a> Curr Opin Rheumatol. 34 (6), 365-373 (2022).</li>
<li>Sato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+to+a+140-kd+polypeptide%2C+CADM-140%2C+in+Japanese+patients+with+clinically+amyopathic+dermatomyositis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies to a 140-kd polypeptide, CADM-140, in Japanese patients with clinically amyopathic dermatomyositis.</a> Arthritis Rheum. 52 (5), 1571-1576 (2005).</li>
<li>Tansley, S. L., Diederichsen, L. P., Zampeli, V. A., McHugh, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reliability+of+immunoassays+to+detect+autoantibodies+in+patients+with+myositis+is+dependent+on+autoantibody+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology%22%5BJournal%5D)">The reliability of immunoassays to detect autoantibodies in patients with myositis is dependent on autoantibody specificity.</a> Rheumatology. 59 (5), 1029-1034 (2020).</li>
<li>Chen, Y. L., Li, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+predictive+value+of+myositis+antibody+line+blot+testing+in+patients+with+suspected+idiopathic+inflammatory+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Positive predictive value of myositis antibody line blot testing in patients with suspected idiopathic inflammatory myopathy.</a> Muscle Nerve. 69 (3), 345-350 (2024).</li>
<li>Nombel, A., Pin, J. J., Fabien, N., Miossec, P., Coutant, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+performance+of+an+indirect+immunofluorescence+assay+for+the+detection+of+anti-MDA5+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the performance of an indirect immunofluorescence assay for the detection of anti-MDA5 antibodies.</a> Biomedicines. 10 (12), 3125(2022).</li>
<li>Nakashima, R., Hosono, Y., Mimori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+and+new+detection+system+of+autoantibodies+in+myositis+with+interstitial+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lupus%22%5BJournal%5D)">Clinical significance and new detection system of autoantibodies in myositis with interstitial lung disease.</a> Lupus. 25 (8), 925-933 (2016).</li>
<li>Sato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+to+a+140-kd+polypeptide%2C+CADM-140%2C+in+Japanese+patients+with+clinically+amyopathic+dermatomyositis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies to a 140-kd polypeptide, CADM-140, in Japanese patients with clinically amyopathic dermatomyositis.</a> Arthritis Rheum. 52 (5), 1571-1576 (2005).</li>
<li>Chang, Y. C., Yang, L., Budhram, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+predictive+value+of+myositis+antibody+line+blot+testing+in+patients+with+suspected+idiopathic+inflammatory+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Positive predictive value of myositis antibody line blot testing in patients with suspected idiopathic inflammatory myopathy.</a> Muscle Nerve. 69 (5), 626-630 (2024).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konkurujących interesów do ogłoszenia. 
Fragmenty tego rękopisu zostały wygenerowane przy pomocy GPT-4 firmy OpenAI. Autorzy przejrzeli i zredagowali treść, aby zapewnić dokładność i oryginalność.

Nasza technika identyfikacji autoprzeciwciał anty-MDA5 oparta na ICC oferuje znaczące przewagi w porównaniu z tradycyjnymi metodami, takimi jak analiza plam linii czy radioimmunoagram. Wcześniej Nombel i in. zgłaszali odpowiednio wartości wrażliwości i swoistości na poziomie 96% i 100%, porównując pośrednią immunofluorescencję (IIF) na komórkach transfekowanych MDA5 z ELISA w kohorcie 23 pacjentów z dermatomiozyozą z anty-MDA5-dodatnim oraz 22 kontrolami anty-MDA5-negatywnymi14. Jednak ten ELISA n...

Idiopatyczne zapalne miopatie (IIM), powszechnie nazywane zapaleniem mięśnia, to heterogeniczna grupa chorób autoimmunologicznych charakteryzujących się przewlekłym zapaleniem mięśni, zmiennymi przejawami klinicznymi oraz różnorodnymi efektami terapeutycznymi. Typowe objawy to osłabienie mięśni, obniżona wytrzymałość oraz mialgia1. Główne podtypy IIM to polimiozytyczne zapalenie (PM) i dermatomyositis (DM), natomiast klinicznie amyopatyczne dermatomyositis (CADM) wyróżnia się charakterystycznymi wysypkami skórnymi podobnymi do tych obserwowanych u DM, ale z minimalnym lub żadnym zaangażowaniem mięśni. Głównym powikłaniem w PM, DM i CADM jest śródmiąższowa choroba płuc (ILD), która dotyka około 40% pacjentów i wiąże się ze zwiększoną śmiertelnością2.
Przebieg kliniczny i rokowania ILD w IIM są bardzo zróżnicowane. ILD powiązany z DM i CADM (DM-/CADM-ILD) zwykle jest bardziej oporny na leczenie i ma gorsze rokowanie niż ILD powiązany z PM. Spośród nich ostra lub podostra ILD, która postępuje szybko w ciągu trzech miesięcy3, jest szczególnie ciężka, z pięcioletnim wskaźnikiem przeżycia wynoszącym zaledwie 52%, w porównaniu do 87% dla przewlekłej ILD, która postępuje powoli lub pozostaje stabilna. Szybko postępujące ILD (RP-ILD), będące podtypem ostrego/podostrego ILD, charakteryzuje się szybkim pojawieniem się duszności oraz rozległym uszkodzeniem pęcherzyka płucnego widocznym na obrazowaniu klatki piersiowej. RP-ILD to stan zagrażający życiu o złym rokowaniu, co podkreśla pilną potrzebę wczesnej diagnozy i szybkiej interwencji w celu poprawy wyników leczenia 4,5,6.
Specyficzne dla zapalenia mięśni (MSA) autoprzeciwciała stały się kluczowymi biomarkerami w ILD związanym z zapaleniem mięśnia, przy czym przeciwciała przeciw MDA5 odgrywają szczególnie istotną rolę. Te autoprzeciwciała są często wykrywane u pacjentów z PM-/DM-/CADM-ILD i stanowią ważne wskaźniki prognostyczne dla RP-ILD 7,8,9. MDA5 (gen związany z różnicowaniem czerniaka 5) to cytosolowy receptor rozpoznawania wzorców kodowany przez gen indukowany interferonem, który wykrywa podwójne RNA wirusowe i mitochondrialne, inicjując odpowiedzi immunologiczne pośredniczone interferonem10. Chociaż dokładne mechanizmy patogeniczne pozostają niejasne, uważa się, że autoprzeciwciała anty-MDA5 zakłócają funkcjonowanie MDA5, przyczyniając się tym samym do patogenezy autoimmunologicznej.
Terminowe wykrycie autoprzeciwciał anty-MDA5 jest niezbędne dla wczesnej identyfikacji i leczenia RP-ILD. Tradycyjnie radioaktywna immunoprecipitacja (IP) z użyciem 35ekstraktów komórek K562 znakowanych przez S-metioninę była uznawana za złoty standard wykrywania autoprzeciwciał anty-MDA511. Jednak ta metoda jest niepraktyczna do rutynowego zastosowania klinicznego ze względu na wysokie koszty, zależność od specjalistycznego sprzętu i wykwalifikowanego personelu, surowe przepisy dotyczące utylizacji odpadów radioaktywnych oraz ograniczoną żywotność odczynników znakowanych radioaktywnie. W praktyce klinicznej testy blot są powszechnie stosowane jako alternatywy; jednak wiążą się one z wysokim wskaźnikiem fałszywie pozytywnych wyników przeciwciał przeciw MDA512,13, co budzi obawy dotyczące dokładności diagnostycznej. W związku z tym pilnie potrzebne jest przeprowadzenie wiarygodnego, nieradioaktywnego testu potwierdzającego, który potwierdzi pozytywne wyniki i poprawi pewność diagnostyczną.
Aby wypełnić tę lukę, proponujemy zastosowanie immunocytochemii (ICC) jako uzupełniającego testu potwierdzającego autoantyciała przeciwciała przeciw MDA5. Podejście to polega na transfekcji komórek HeLa za pomocą konstruktu MDA5, inkubacji komórek osoczem pacjenta oraz wykrywaniu związanych autoprzeciwciał anty-MDA5 przy użyciu przeciwciał wtórnych sprzężonych z enzymami (np. peroksydaza chrzanu) połączonych z chromogenicznym substratem do wizualizacji pod mikroskopem świetlnym. ICC zapewnia nieradioaktywną, wysoce czułą i standaryzowaną platformę do wizualizacji autoprzeciwciał przeciw MDA5 w przedziałach komórkowych. Poprzez integrację ICC z testem blotowym, metoda ta ma na celu zmniejszenie wskaźnika fałszywie pozytywnych wyników, poprawę dokładności diagnostycznej oraz ostatecznie poprawę zarządzania klinicznego i wyników leczenia pacjentów.
Celem tego badania jest ustanowienie solidnego, nieradioaktywnego protokołu wykrywania autoprzeciwciał anty-MDA5, odpowiadającego na ograniczenia obecnych metod wykrywania oraz oferującego klinicystom praktyczne i wiarygodne narzędzie do wczesnej diagnozy RP-ILD u pacjentów z PM, DM i CADM. W towarzyszącej narracji wideo ten zagrażający życiu kurs jest potocznie opisywany jako "szybka śmierć"; naukowo odpowiada to szybko postępującemu ILD (RP-ILD). Prace te opierają się na istniejących dowodach i mają potencjał do znaczącej poprawy oceny prognosycznej oraz podejmowania decyzji terapeutycznych w praktyce klinicznej.

<table><tbody><tr><td>Płytki z 24 dołkami (1,9 cm&sup2;/well)</td><td>Corning</td><td>354541</td><td></td></tr><tr><td>Antymikotyk antybiotykowy</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Zlewki</td><td>PYREX</td><td>1000-600</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe lampy (15 mL)</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe lampy (50 mL)</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>Dejonizowana woda destylowana</td><td></td><td></td><td>Nasza destylowana woda destylowana jest produkowana wewnętrznie przy użyciu systemu Milli-Q (Kolumna 1: Quantum TEX, SN: F4EB53476; Kolumna 2: Prepak, SN: F1CB11442)</td></tr><tr><td>Charakteryzowane surowicę bydła płodową</td><td>Cytiva</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>cylindry stopniowane (50 mL)</td><td>VITLAB</td><td>64804</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksylin Gill II</td><td>Leica</td><td>3801522</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Dulbecco' s Modified Eagle Medium o wysokiej glukozie</td><td>Cytiva</td><td>SH30243.02</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000 reagent transfekcyjny</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>Odczynnik transfekcyjny</td></tr><tr><td>MDA-5 (D74E4) Królik mAb</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>5321</td><td></td></tr><tr><td>Rurki mikrowirówkowe (1,5 mL probówki Eppendorfa)</td><td>AXYGEN</td><td>142503</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I substrat surowicy</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Orbitalny shaker (opcjonalnie)</td><td>FIRSTEK</td><td>S300R</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>4% w 1x PBS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>PRO TECH</td><td>ME222605</td><td></td></tr><tr><td>pENTER-MDA5</td><td>Vigene Biosciences Inc.</td><td>CH863586</td><td></td></tr><tr><td>Peroksydaza AffiniCzyste kozi, antyludzkie IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler pipety</td><td>Thermo Scientific</td><td>130165</td><td></td></tr><tr><td>Pipety&nbsp;</td><td>GILSON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety i końcówki pipetek (10 & mikro; L)</td><td>QSP</td><td>104-Q</td><td></td></tr><tr><td>Pipety i końcówki pipetek (200 & mikro; L)</td><td>QSP</td><td>T090-Q</td><td></td></tr><tr><td>Pipety i końcówki pipetek (1000 & mikro; L)</td><td>QSP</td><td>111-Q</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne (5 mL)</td><td>SPL</td><td>91005</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne (10 mL)</td><td>SPL</td><td>91010</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne (25 mL)</td><td>SPL</td><td>91025</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw podłoża SignalStain DAB</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>8059</td><td>0,3% w PBS</td></tr></tbody></table>

wykrywanie autoprzeciwciał anty-mda5 za pomocą komórek hela oraz immunocytochemii za pomocą mikroskopii świetlnej

Detection of Anti-MDA5 Autoantibodies Using HeLa Cells and Immunocytochemistry with Light Microscopy

Autoprzeciwciała przeciw MDA5 są kluczowymi biomarkerami dermatomyositis (DM), amyopatycznego zapalenia dermatomyositis (CADM) oraz polimiozytycznego zapalenia (PM), szczególnie w identyfikacji pacjentów z ryzykiem szybko postępującej śródmiąższowej choroby płuc (RP-ILD). Wczesne wykrycie tych autoprzeciwciał jest niezbędne dla poprawy wyników leczenia pacjentów, ponieważ opóźniona diagnoza często prowadzi do złych rokowań. Obecnie test radioimmunotest jest złotym standardem wykrywania anty-MDA5, jednak jego zastosowanie jest ograniczone przez wysokie koszty, długotrwałe procedury oraz potrzebę specjalistycznej wiedzy. Dodatkowo, test blotowy, szeroko stosowane narzędzie kliniczne, wykazuje wysoki wskaźnik fałszywie pozytywnych przeciwciał przeciwciał MDA5, co może obniżać dokładność diagnostyczną. Aby rozwiązać te ograniczenia, proponujemy nieradioaktywną, wysoce czułą i standaryzowaną metodę testów potwierdzających z wykorzystaniem immunocytochemii (ICC). Protokół ten polega na leczeniu komórek HeLa konstruktem MDA5, permeabilizacji komórek Tritonem X-100 w celu ułatwienia wiązania pierwotnych autoprzeciwciał przeciw MDA5 oraz wykrywaniu przeciwciał związanych z wiązaniem za pomocą enzymatycznych przeciwciał wtórnych (np. peroksydaza chrzanu) za pomocą chromogenu DAB do mikroskopii. ICC oferuje praktyczne, opłacalne i wysokoczułe podejście do wizualizacji autoprzeciwciał anty-MDA5 w strukturach komórkowych. Integrując ICC jako uzupełniającą procedurę potwierdzającą, badanie ma na celu zwiększenie wiarygodności wykrywania anty-MDA5, a tym samym ulepszenie strategii diagnostycznych i prognostycznych dla RP-ILD u pacjentów z DM, APM i PM.

Personel przeprowadzający testy był ślepy na tożsamość próbek, w tym na konkretnych pacjentów, od których je pozyskano, aby zminimalizować potencjalne błędy w procesie oceny. Jednak choć zdrowe próbki kontrolne nie były poddawane oślepianiu, konsekwentnie dawały jasne i jednoznaczne wyniki.
Rysunek 1A pokazuje skuteczną ekspresję MDA5 w komórkach HeLa transfekowanych za pomocą konstrukcji pENTER-MDA...

Oferujemy metodologię immunocytochemii (ICC) krok po kroku do wykrywania anty-MDA5. Podejście to obejmuje utrwalanie komórek, permeabilizację, inkubację przeciwciał oraz techniki obrazowania, które pozwalają na dokładne wykrywanie autoprzeciwciał przeciw MDA5, wspomagając diagnozę szybko postępującej śródmiąższowej choroby płuc u pacjentów z zapaleniem mięśnia.

Wykrywanie autoprzeciwciał anty-MDA5 za pomocą komórek HeLa oraz immunocytochemii za pomocą mikroskopii świetlnej

Anti-MDA5 autoantibodies are critical biomarkers for dermatomyositis (DM), amyopathic dermatomyositis (CADM), and polymyositis (PM), particularly in ...

Głównym celem następującego eksperymentu jest wykorzystanie immunocytochemii do wykrywania przeciwciał anty-MDA5. Odbywa się to poprzez wykorzystanie komórek HeLa, a następnie transfekcję komórki HeLa za pomocą konstruktu MDA5. W związku z tym komórki HeLa produkują białka MDA5, które mogą być przyłączane przez przeciwciała MDA5.Po włączeniu komórki HeLa do konstrukcji MDA5, odczynnik Triton służy do przepuszczania błony komórek HeLa, co pozwala na przepuszczenie przeciwciał anty-MDA5. Następnie dodaje się surowicę pacjenta zawierającą przeciwciała przeciwciała przeciw MDA5. Przeciwciała anty-MDA5 przyczepiłyby się następnie do białek MDA5 wewnątrz komórek HeLa.Następnie do komórek wprowadzane są przeciwciała wtórne, do których przyczepiona jest nadtlenaza chrzanu, a przeciwciała wtórne przyczepiają się do przeciwciał przeciw MDA5. Na koniec chromogen jest dodawany do komórek i utleniany w obecności przeciwciał wtórnych sprzężonych z peroksydazą chrzanu, co daje widoczny kolor pod mikroskopem optycznym. Pozytywny wynik w stanie startowym pokazałby coś podobnego do powyższego zdjęcia.W dzisiejszej demonstracji wideo przechodzimy do kluczowego obszaru badań medycznych – wykrywania przeciwciała związanego z różnicowaniem czerniaka – genu numer pięć, zwanego także przeciwciałem anty-MDA5. Te autoprzeciwciała odgrywają kluczową rolę jako prosty wskaźnik diagnostyczny dla pacjentów z chorobą śródmiąższową płuc, zwłaszcza tych z szybko postępującymi chorobami. Znaczenie tych badań polega na ich potencjalnym wpływie na wyniki leczenia pacjentów. Wczesne i dokładne wykrycie autoprzeciwciał MDA5 jest kluczowe dla skutecznego zarządzania tą ciężką chorobą autoimmunologiczną.Główną zaletą metody, którą pokazaliśmy w porównaniu z złotą metodą przesiewowego autoprzeciwciał anty-MDA5, jest to, że można ją wykonać szybciej oraz zaoszczędzić czas i wysiłek w porównaniu do tradycyjnego radioaktywnie znakowanego testu immunowizytacyjnego. Ta zwiększona wydajność pozwala nam przetwarzać więcej próbek i szybko generować wyniki. Ponadto należy zauważyć, że nasza metoda nie tylko zapewnia wyższą wydajność, ale także bezpieczeństwo i opłacalność w porównaniu z testem immunoprecypitacyjnym przejściowym.Zobaczmy teraz, jak to się robi. Mój asystent badawczy, Teo Kai Fa, poprowadzi ten zabieg. Utrzymuj komórki HeLa za pomocą Zmodyfikowanego Medium Orła Dulbecco, zawierającego 10% surowicy płodowej bydła oraz 1% antymykotycznego antymikotyku w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonej atmosferze o zawartości 5% CO2.Przepuszczaj komórki co dwa do trzech dni lub gdy komórki osiągną 90 do 100% konfluentności. Umieść 70 000 komórek HeLa na każdym odwiercie przy płycie 24-dołowej. 24 godziny przed transfekcją i połącz komórki, które mają około 90% współbycia.Rozcieńcz po 500 nanogramów plazminy i 1,5 mikrolitra odczynnika transfekcyjnego każdy w 25-mikrolitrowym medium surowicy o pojemności 25 mikrolitrów. Dodaj rozcieńczone DNA, rozcieńczony odczynnik transfekcyjny w proporcji jeden do jednego. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez pięć minut.Dodaj mieszankę do komórek umieszczonych dzień wcześniej i natychmiast mieszaj, aby wymieszać kompleks lipidowy DNA. Potwierdź, że komórki są łączne w 80 do 90%. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonej półkuli o zawartości 5% CO2, przez 40 do 4 godzin, a następnie przekonuj immunocytochemię.Używamy komercyjnie dostępnego czynnika. Więcej informacji można znaleźć w tabeli materiałów. Skuteczność transfekcji wynosi 50%. Skuteczność transfekcji i ekspresji docelowego białka można określić, transfekując komórki plazmidem z mrożonym białkiem ekspresyjnym oraz przewodząc zachodnią krew, aby wizualizować ekspresję docelowego białka. Po inkubacji dwukrotnie przemyj komórki PBS, aby usunąć wszelkie pozostałe nośniki.Mycie można wykonać poprzez potrząsanie talerzem lub wstrząsaczką orbitalną. Zabezpiecz komórki 4% paraformaldehydem w PBS. Uwaga. Paraformaldehyd jest toksyczny.Stosuj odpowiednie zasady postępowania. Zostaw ogniwa na 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie pozbądź się odczynnika utrwalającego.Użyj PBS do dwukrotnego mycia komórki. Nałóż odczynnik trytonowy, a następnie pozwól komórkom odczekać 10 minut w temperaturze pokojowej. Użyliśmy Triton X 400 w PBS w stężeniu 0,3%. Po 10 minutach wyrzuciliśmy odczynnik Triton.Dodaj PBS do przeprania komórek raz. Następny krok: wykonaj blokowanie z 10% surowicą bydła płodowego w PBS i pozostawienie komórek na godzinę w temperaturze pokojowej. Usuń odczynnik blokujący. Następnie dodaj PBS, aby raz przemyć komórki.Dodaj rozcieńczoną plazmę pacjenta do komórek. Przed użyciem należy rozcieńczyć osocza pacjenta w stosunku 1 do 5 000 w PBS. Dostosowuj rozcieńczenie, aby wzmocnić sygnał lub zmniejszyć tło w razie potrzeby, aby zapewnić obiektywne rezultaty.Personel przeprowadził test, nie mając wiedzy, które próbki należą do pacjentów, a które do zdrowych osób. Inkubuj próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 12 do 16 godzin. Po upływie okresu inkubacji pobierz próbkę pacjenta i przepłucz komórki trzykrotnie PBS.Należy podleczyć komórki rozcieńczonym IgG sprzężonym z chrzanem i nadoksydazą, antyludzkim w stosunku 1 do 250 w PBS. Zostaw ogniwa na godzinę w temperaturze pokojowej. Godzinę później pozbądź się przeciwciał wtórnych.Przepłucz PBS trzy razy. Po umyciu komórek barw je roztworem roboczym DAB o pojemności 300 mikrolitrów na dołek. Rozwiązanie robocze DAB jest przygotowywane przez brak koncentratu promocyjnego DAB oraz rozcieńczalnika DAB zgodnie z instrukcjami producenta.Po pięciu minutach barwienia komórki usuń barwnik. Po usunięciu barwnika przepłukaj jonizowaną wodą destylowaną i potrząsaj przez pięć minut. Zbarwij jądro komórkowe rozcieńczoną hematotoksyną.Używamy hemotoksyny w 10-stopniowym rozcieńczeniu. Poczekaj pięć minut na proces bejcowania. Po pięciu minutach usuń hemotoksynę, a następnie przemyj analizowaną wodą destylowaną dwukrotnie po pięć minut każdy.Ostatni krok: obserwowanie wyników barwienia pod mikroskopem optycznym. Zinterpretujmy wyniki testów immunocytochemii dla autoprzeciwciał anty-MDA5. Pozytywny wynik.Prawdziwy plus pokazuje silne brązowe przebarwienia wewnątrz HeLa ekspresujące MDA5. Potwierdza to obecność autoprzeciwciał anty-MDA5 w próbce pacjenta. Negatywny wynik.Wynik negatywny pokazuje komórki HeLa bez brązowego przebarwienia, co wskazuje na brak autoprzeciwciał przeciw MDA5. Wynik fałszywie pozytywny. Co istotne, fałszywie pozytywny wynik wykazuje rozległe brązowe przebarwienia we wszystkich komórkach, niezależnie od ekspresji MDA5.To niespecyficzne zabarwienie obserwowane w chorobach autoimmunologicznych musi być odróżnione od prawdziwie pozytywnego, aby uniknąć błędnej diagnozy. Nasza metoda oferuje szybszy, bezpieczniejszy i bardziej opłacalny sposób wykrywania przeciwciał przeciwnarządowych przeciwciał anty-MDA5. Ma to potencjał istotnego wpływu na wyniki leczenia leczenia chorób śródmiąższowych płuc.Po wyświetleniu tego filmu nauczysz się, jak wykonać procedurę immunocytochemii oraz jak rozpoznać kliniczne istoty w wynikach testu.

detection-anti-mda5-autoantibodies-using-hela-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

W ostatnich latach testy oparte na żywych komórkach były z powodzeniem wykorzystywane do wykrywania przeciwciał przeciwko antygenom powierzchniowym i konformacyjnym. W tym miejscu opisano metodę wykorzystującą wysokoprzepustową cytometrię przepływową, umożliwiającą analizę dużych kohort pacjentów. Wykrycie nowych przeciwciał poprawi diagnostykę i leczenie zaburzeń o podłożu immunologicznym.

Wysokoprzepustowy test cytometrii przepływowej oparty na komórkach do wykrywania przeciwciał przeciwko receptorowi N-metylo-D-asparaginianu lub receptorowi dopaminy-2 w ludzkiej surowicy

Tutaj opisujemy dwa testy do pomiaru aktywacji dopełniacza indukowanej przez przeciwciała przeciwko czerwonym krwinkom. Główną przewagą nad obecnymi testami jest ich ilościowy i łatwy w interpretacji charakter.

Metody ilościowego wykrywania indukowanej przez przeciwciała aktywacji dopełniacza na krwinkach czerwonych

Protokół wykrywania samoreaktywnych limfocytów T CD4 w mózgu i sercu poprzez bezpośrednie barwienie głównymi dekstramerami klasy II kompleksu zgodności tkankowej został opisany w tym raporcie. Do kompleksowej analizy opracowano również wiarygodną metodę wyliczania częstości występowania limfocytów T CD4+ specyficznych dla antygenu in situ.

In Situ Wykrywanie autoreaktywnych limfocytów T CD4 w mózgu i sercu przy użyciu dekstramerów klasy II o głównym kompleksie zgodności tkankowej

Zrozumienie konformacji antygenów powierzchniowych wirusa jest niezbędne do oceny neutralizacji przeciwciał i kierowania projektem skutecznych immunogenów szczepionkowych. W tym miejscu opisujemy komórkowy test ELISA, który umożliwia badanie rozpoznawania trimerycznego HIV-1 Env ulegającego ekspresji na powierzchni transfekowanych komórek przez specyficzne przeciwciała anty-Env.

Ocena konformacyjna glikoprotein otoczki trymerowej HIV-1 przy użyciu komórkowego testu ELISA

Nienaruszone kompleksy HLA/peptydowe klasy I są wydalane przez komórki rakowe, co stanowi potencjalnie istotny biomarker raka. Wykorzystując technologię czujników bezznacznikowych i przeciwciała monoklonalne naśladujące receptor limfocytów T, demonstrowano wykrywanie wydalanych kompleksów MIF/HLA-A*02:01 w supernatantach komórkowych MDA-MB-231, wzbogaconej surowicy ludzkiej i osoczu pacjenta, co umożliwiło opracowanie nowej platformy diagnostycznej raka.

Wykrywanie biomarkerów ludzkiego antygenu leukocytów w raku piersi z wykorzystaniem technologii biosensorów bez znaczników

Opisujemy tutaj metodę generowania konfigurowalnych mikromacierzy antygenowych, które mogą być używane do jednoczesnego wykrywania autoprzeciwciał IgG i IgM w surowicy od ludzi i myszy. Macierze te pozwalają na wysokoprzepustowe i ilościowe wykrywanie przeciwciał przeciwko dowolnemu antygenom lub epitopom.

Generacja dwukolorowych mikromacierzy antygenowych do jednoczesnego wykrywania autoprzeciwciał IgG i IgM

Ektopowo wyraziliśmy podjednostkę NR1 receptora NMDA oznaczoną zielonym białkiem fluorescencyjnym w ludzkich komórkach embrionalnych (HEK293) jako antygen do wykrywania autoprzeciwciał przeciwko receptorowi NMDA we krwi pacjentów z podejrzeniem autoimmunologicznego zapalenia mózgu. Ta prosta metoda może być odpowiednia do celów przesiewowych w warunkach klinicznych.

Prosty test immunofluorescencyjny oparty na komórkach do wykrywania autoprzeciwciał przeciwko receptorowi N-metylo-D-asparaginianu (NMDA) we krwi

Automatyczne przeciwciała DFS70 naśladują powszechne wzorce przeciwciał przeciwjądrowych związanych z chorobami, co utrudnia dokładną interpretację przy użyciu konwencjonalnych substratów HEp-2. Protokół opisuje zalety nowatorskiego zmodyfikowanego substratu HEp-2 w porównaniu z konwencjonalnym HEp-2 w badaniach przesiewowych ANA i rozróżnianiu wzorców DFS70 z dużą pewnością zarówno w monospecyficznych, jak i mieszanych przypadkach dodatnich ANA.

Jednoczesne rozróżnianie monospecyficznych i mieszanych wzorców DFS70 podczas badań przesiewowych ANA za pomocą nowatorskiego podłoża do nokautowania HEp-2 ELITE/DFS70

Opisujemy model immunizacji in vivo, translacyjnego zapalenia wątroby u myszy BALB/c, który może być wykorzystany do badania patogenezy indukowanego lekami autoimmunologicznego zapalenia wątroby, w tym różnic płci obserwowanych w tej chorobie. Opiszemy, w jaki sposób model ten demonstruje powtarzalne analizy przy użyciu technik eksperymentalnych in vivo i in vitro.

Indukcja indukowanego przez leki, autoimmunologicznego zapalenia wątroby u myszy BALB/c w celu zbadania jego mechanizmów patogennych

Ten artykuł zawiera szczegółową metodologię pomiaru izolewukleryn w tkankach metodą immunofluorescencji przy użyciu przeciwciała ScFv D11 sprzężonego z fosfatazą alkaliczną. Modele nadciśnienia zarówno u myszy, jak i u ludzi są wykorzystywane do wyjaśnienia krok po kroku procedur i podstawowych zasad związanych z pomiarem izolewuklesyny w próbkach tkanek.

Bezpośrednie wykrywanie izolewuglandyn w tkankach przy użyciu białka fuzyjnego fosfatazy alkalicznej D11 scFv i immunofluorescencji

W zakażeniu Mycoplasma pneumoniae, testy serologiczne mogą dać dobre wyniki, ale z niską swoistością ze względu na immunologiczną reakcję krzyżową. Opisany w tym artykule wewnętrzny test ELISA do wychwytywania antygenu gwarantuje wysoką swoistość gatunkową i okazał się wiarygodnym testem przesiewowym do dokładnej diagnozy M. pneumoniae.

Test immunoenzymatyczny wychwytujący antygen do specyficznego wykrywania Mycoplasma pneumoniae

Poznaj metodę immunocytochemii do wykrywania autoprzeciwciał anty-MDA5 przy użyciu komórek HeLa. Ta technika umożliwia szybszą i bardziej ekonomiczną diagnostykę mięśniaków związanych z chorobami płuc.

Wykrywanie autoprzeciwciał anty-MDA5 za pomocą komórek HeLa oraz immunocytochemii za pomocą mikroskopii świetlnej

Przeglądaj więcej filmów