Name: Ekstrakcja DNA prątków za pomocą bicia kulek w niestandardowym buforze, a następnie przepływu pracy NGS (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Poznaj szybką ekstrakcję DNA z Mycobacterium tuberculosis metodą bicia kulek i oczyszczania na kulkach magnetycznych. Protokół zapewnia wysokie plony DNA kompatybilne z sekwencjonowaniem NGS w warunkach ograniczonych zasobów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R01AI153213 Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych (NIAID).

Badanie to zostało przeprowadzone na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco (UCSF) za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Bezpieczeństwa Biologicznego (BUA #BU198320-01GBUA/BABB) i jest zgodne z wytycznymi UCSF dotyczącymi etyki badań. Uzyskaliśmy resztki próbek plwociny pobranych przez Discovery Life Sciences w ramach zatwierdzonego przez IRB protokołu zrzeczenia się zgody od osób z chorobami układu oddechowego innymi niż gruźlica.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Niestandardowy bufor Triton (Tabela 1): Aby przygotować 100 ml niestandardowego buforu Triton, zacznij od połączenia 2 ml 5 M NaCl, 1 ml 1 M Tris-HCl (pH 8), 1 ml Triton X-100 i 0,2 ml 0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Dodaj ultraczystą wodę, aby uzyskać całkowitą objętość do 100 ml. Filtr wysterylizuj przed użyciem. Końcowy bufor zawiera 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA i 1% Triton X-100.</li>
	<li>Niski poziom EDTA TE (Tabela 2): Aby przygotować 100 ml buforu o niskiej zawartości EDTA TE, połącz 1 ml 1M Tris-HCl (pH 8) i 0,02 ml 0,5 M EDTA. Dodaj ultraczystą wodę, aby uzyskać całkowitą objętość do 100 ml. Końcowy bufor zawiera 10 mM Tris-HCl i 0,1 mM EDTA.</li>
</ol>
2. Przygotowanie probówek do lizy
<ol>
	<li>Za pomocą ostrza skalpela ostrożnie odetnij spód zakrętki o pojemności 1,5 ml tuż poniżej punktu przegięcia.</li>
	<li>Odetnij końcówkę końcówki P1000, wytnij klin w kształcie litery V w pobliżu końca i zaklinuj w nim przygotowane dno rurki z nakrętką. Patrz rysunek 1 , aby zapoznać się ze schematem czerpaka.</li>
	<li>Napełnij sterylny pojemnik (np. zbiornik lub szalkę Petriego) 0,1 mm kulkami cyrkonowo-krzemianowymi i za pomocą przygotowanej miarki rozprowadź jedną miarkę kulek (~200 mg) w probówkach z nakrętką o pojemności 1,5 ml.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68037/68037fig1.jpg"> 
Rysunek 1: Wewnętrzna miarka do dystrybucji ściegów. Szufelka została zaprojektowana z myślą o łatwym przenoszeniu ~200 mg kulek cyrkonowych o średnicy 0,1 mm do probówek przetwórczych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68037/68037fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
3. Przygotowanie danych wejściowych
UWAGA: Całe przygotowanie próbki powinno być przeprowadzone zgodnie z protokołami bezpieczeństwa biologicznego obowiązującymi w zakładzie. Zdecydowanie zalecamy obchodzenie się z materiałami zakaźnymi wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego klasy II (BSC), aby zminimalizować ryzyko narażenia na aerozol.
<ol>
	<li>Hodowla komórek bakteryjnych<ol>
		<li>Odwirować ~ 5 ml kultury M. tuberculosis (MGIT lub mętnej płynnej hodowli) w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml z maksymalną prędkością (≥ 3 000 x g) przez 10 min.</li>
		<li>Używając pipety serologicznej o pojemności 10 ml, ostrożnie usunąć całość z wyjątkiem ~ 500 μl supernatantu, nie naruszając osadu. Usunąć pozostały supernatant za pomocą pipety P1000 bez naruszania osadu.</li>
		<li>Zawiesić osad w 350 μl niestandardowego buforu Triton, pipetując w górę iw dół. W razie potrzeby (tj. w celu usunięcia próbek do przetwarzania poza BSL-3), należy dezaktywować próbkę zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie plwociny<ol>
		<li>Przenieś 1-5 ml próbki plwociny (spontanicznej lub indukowanej) do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Upłynnianie naziemnej telewizji cyfrowej (DTT)<ol>
		<li>Dodać cztery objętości 100 mM ditiotreitolu do próbki plwociny (objętość może się różnić). W przypadku korzystania z komercyjnego odczynnika należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi rozcieńczania.</li>
		<li>Dokładnie wirować przez 30 s. Inkubować w temperaturze pokojowej (20-25 °C) przez 7 minut. Wiruj ponownie przez 30 s.</li>
		<li>Powtórz kroki 3.3.1. oraz 3.3.2. 1x, dla bardzo lepkich próbek, wykonaj do 5 cykli inkubacyjno-wirowych.</li>
		<li>Wirować z maksymalną prędkością (≥ 3 000 x g) przez 10 min. Używając pipety serologicznej o pojemności 10 ml, ostrożnie wyrzucić wszystkie oprócz ~ 500 μl supernatantu. Usunąć pozostały supernatant za pomocą pipety P1000 bez naruszania osadu.</li>
		<li>Zawiesić granulat w 350 μl niestandardowego bufora Triton.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Upłynnianie NALC-NaOH<ol>
		<li>Aby przygotować roztwór NALC-NaOH, postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi przygotowania i rozcieńczania.</li>
		<li>Dodać cztery objętości roztworu NALC-NaOH do próbki plwociny (spontanicznej lub indukowanej, objętość może się różnić).</li>
		<li>Wir przez 30 s. Inkubować w temperaturze pokojowej (20-25 °C) przez 7 minut. Powtórz kroki 3.4.1 i 3.4.2. 1x. W przypadku bardzo lepkich próbek należy wykonać do 5 cykli inkubacji i wiru.</li>
		<li>Dodaj PBS do oznaczenia 50 ml. Krótko zmieszaj, aby wymieszać. Wirować z maksymalną prędkością (≥ 3 000 x g) przez 10 min.</li>
		<li>Używając pipety serologicznej o pojemności 50 ml, ostrożnie wyrzucić wszystkie oprócz ~ 500 μl supernatantu. Usunąć pozostały supernatant za pomocą pipety P1000 bez naruszania osadu.</li>
		<li>Zawiesić granulat w 350 μl niestandardowego bufora Triton. W razie potrzeby (tj. w celu usunięcia próbek do przetwarzania poza BSL-3), należy dezaktywować próbkę zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Ekstrakcja DNA
<ol>
	<li>Przenieś inaktywowaną zawiesinę bakteryjną (350 μl z kroku 3) do nowej, dobrze oznakowanej probówki z nakrętką o pojemności 1,5 ml zawierającej ~250 μl kulek cyrkonowo-krzemianowych o średnicy 0,1 mm.</li>
	<li>Ścieg pokonywał lizat z prędkością 6,5 m/s przez 45 s z 2-minutowym odpoczynkiem między przejazdami. Powtórz w sumie trzy cykle ubijania koralików.</li>
	<li>Wirować z maksymalną prędkością (≥ 12 000 x g) przez 2 minuty i przenieść 150 μl supernatantu do nowej, dobrze oznakowanej probówki. Uważaj, aby nie przenosić koralików ani resztek komórek.</li>
	<li>Pozwól, aby kulki magnetyczne czyszczące zrównoważyły się do temperatury pokojowej przez 30 minut i dokładnie zwiruj, aby zapewnić całkowite ponowne zawieszenie przed użyciem.</li>
	<li>Dodaj 180 μl (1,2x objętość) kulek magnetycznych cleanup i mieszaj, pipetując w górę i w dół 10x. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.</li>
	<li>Umieść na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż roztwór się klaruje przez ~ 2 min. Za pomocą pipety P200 ostrożnie wyrzuć supernatant, nie naruszając kulek magnetycznych.</li>
	<li>Trzymając probówkę nadal na stojaku magnetycznym, dodać 500 μl świeżo przygotowanego 70 % (v/v) etanolu, dozując wzdłuż przeciwległej ścianki rurki do kulek magnetycznych. Poczekaj 30 sekund.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.5. - 4.7. w sumie dwa prania. Pod koniec ostatniego prania usuń resztki etanolu za pomocą pipety P10. Suszyć koraliki krótko przez ~ 2 min.</li>
	<li>Natychmiast po tym, jak granulka stanie się nieprzezroczysta, wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego i ponownie zanurz w 20 μl buforu Tris o niskiej zawartości EDTA. Nie pozwól, aby koraliki wyschły i popękały.</li>
	<li>Wymieszać przez pipetowanie lub wirowanie, aby upewnić się, że wszystkie kulki są w roztworze. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Umieść na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż roztwór stanie się klarowny przez ~ 2 min. Przenieś wymyte DNA do nowej, dobrze oznakowanej probówki w celu dalszej analizy. Odessać &lt;20 μl wyekstrahowanego DNA, aby uniknąć przeniesienia kulek magnetycznych.</li>
</ol>
5. Oznaczanie liczby prątków DNA metodą qPCR
<ol>
	<li>Aby określić ilościowo DNA prątków przy użyciu ilościowej reakcji PCR ukierunkowanej na 99 nukleotydów prątków atpE (Rv1305), należy zebrać 10 μl mieszaniny reakcyjnej na próbkę na lodzie zawierającej 5 μl uniwersalnej mieszanki głównej sondy (2x), po 0,4 μl startera do przodu (5'-AATTCCTGGTGTAGCGGTGG-3', 10 μM) i startera odwrotnego (5'-GTTTACGGCGTGGACTACCA-3', 10 μM), 0,2 μL sondy TaqMan (5'-VIC-AGGAGGAACACCGGTGGCGA-MGB-3', 10 μM), 2 μL matrycy DNA i 2 μL wody wolnej od nukleaz (Tabela 3).</li>
	<li>Przeprowadzić reakcję, stosując następujące warunki cyklicznych przewidywań termicznych: początkowa denaturacja w temperaturze 95 °C przez 60 s, a następnie 35 cykli w temperaturze 95 °C przez 10 s i 60 °C przez 30 s (z wychwytywaniem w tym miejscu, przy zastosowaniu szybkości narastania 2,11 °C/s; Tabela 4). UWAGA: W tym przypadku qPCR przeprowadzono przy użyciu testu TaqMan z sondą znakowaną VIC w systemie QuantStudio 3 Real-Time PCR,</li>
	<li>Uruchom wszystkie próbki, standardy i kontrolki w trzech egzemplarzach technicznych. Wygeneruj krzywe wzorcowe przy użyciu seryjnych rozcieńczeń oczyszczonego DNA M. tuberculosis . Wykonaj względną analizę ilościową za pomocą oprogramowania do analizy.</li>
	<li>Wyeksportuj wynikowe względne wartości kwantyfikacji do formatu CSV i wizualizuj za pomocą programu R Studio (wersja 2024.09.1+394), aby wygenerować wykresy pudełkowe porównujące wydajność DNA w różnych metodach ekstrakcji.</li>
</ol>

<ol><li>Jouet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+amplicon+sequencing+for+culture-free+prediction+of+susceptibility+or+resistance+to+13+anti-tuberculous+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Deep amplicon sequencing for culture-free prediction of susceptibility or resistance to 13 anti-tuberculous drugs.</a> Eur Respir J. 57 (3), 2002338(2021).</li>
<li>George, S., et al. DNA Thermo-Protection Facilitates Whole Genome Sequencing of Mycobacteria Direct from Clinical Samples by the Nanopore Platform. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGeorge%2C+S+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2020).</li>
<li>Doyle, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+whole-genome+sequencing+of+sputum+accurately+identifies+drug-resistant+mycobacterium+tuberculosis+faster+than+MGIT+culture+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct whole-genome sequencing of sputum accurately identifies drug-resistant mycobacterium tuberculosis faster than MGIT culture sequencing.</a> J Clin Microbiol. 56 (8), e00666-e00718 (2018).</li>
<li>Noordhoek, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+Specificity+of+PCR+for+Detection+of+Mycobacterium+Tuberculosis%3A+A+Blind+Comparison+Study+among+Seven+Laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and Specificity of PCR for Detection of Mycobacterium Tuberculosis: A Blind Comparison Study among Seven Laboratories.</a> J Clin Microbiol. 32, (1994).</li>
<li>Jaber, M., Rattan, A., Verma, A., Tyagi, J., Kumar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+DNA+extraction+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tubercle+Lung+Dis%22%5BJournal%5D)">A simple method of DNA extraction from Mycobacterium tuberculosis.</a> Tubercle Lung Dis. 76 (6), 578-581 (1995).</li>
<li>Käser, M., Ruf, M. T., Hauser, J., Marsollier, L., Pluschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+method+for+preparation+of+DNA+from+pathogenic+and+environmental+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimized method for preparation of DNA from pathogenic and environmental mycobacteria.</a> Appl Environ Microbiol. 75 (2), 414-418 (2009).</li>
<li>De Almeida, I. N., Da Silva Carvalho, W., Rossetti, M. L., Costa, E. R. D., De Miranda, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Six+Different+DNA+Extraction+Methods+for+Detection+of+Mycobacterium+Tuberculosis+by+Means+of+PCR-IS6110%3A+Preliminary+Study%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Six Different DNA Extraction Methods for Detection of Mycobacterium Tuberculosis by Means of PCR-IS6110: Preliminary Study.</a> BMC Res Notes. 6, 561(2013).</li>
<li>Pan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+four+DNA+extraction+methods+for+detecting+Mycobacterium+tuberculosis+by+real-time+PCR+and+its+clinical+application+in+pulmonary+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison of four DNA extraction methods for detecting Mycobacterium tuberculosis by real-time PCR and its clinical application in pulmonary tuberculosis.</a> J Thorac Dis. 5 (3), 251-257 (2013).</li>
<li>Kelly-Cirino, C., Niles, J., Ray, B., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKelly-Cirino%2C+C+%22Maximizing+Mycobacterium+Tuberculosis+DNA+Yield+for+Molecular+Methods+with+PrepIT.MAX%22">Maximizing Mycobacterium Tuberculosis DNA Yield for Molecular Methods with PrepIT.MAX</a>. PD-WP-00045 (Issue 2/2015-11), Accessed January 27 (2020).</li>
<li>Votintseva, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Same-day+diagnostic+and+surveillance+data+for+tuberculosis+via+whole-genome+sequencing+of+direct+respiratory+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Same-day diagnostic and surveillance data for tuberculosis via whole-genome sequencing of direct respiratory samples.</a> J Clin Microbiol. 55 (5), 1285-1298 (2017).</li>
<li>Odumeru, J., Gao, A., Chen, S., Raymond, M., Mutharia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+Bead+Beater+for+Preparation+of+Mycobacterium+Paratuberculosis+Template+DNA+in+Milk%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Use of the Bead Beater for Preparation of Mycobacterium Paratuberculosis Template DNA in Milk.</a> Can J Vet Res. 65 (4), 201-205 (2001).</li>
<li>Oh, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Effective+Method+of+RNA+Extraction+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An Effective Method of RNA Extraction from Mycobacterium tuberculosis.</a> Ann Clin Microbiol. 19 (1), 20-23 (2016).</li>
<li>Miyata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+quality+of+dna+extracted+by+two+techniques+from+mycobacterium+tuberculosis+for+fast+molecular+identification+and+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of the quality of dna extracted by two techniques from mycobacterium tuberculosis for fast molecular identification and genotyping.</a> Braz J Microbiol. 42 (2), 774-777 (2011).</li>
<li>Votintseva, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+DNA+extraction+for+whole-genome+sequencing+from+early+positive+liquid+%28MGIT%29+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial DNA extraction for whole-genome sequencing from early positive liquid (MGIT) cultures.</a> J Clin Microbiol. 53 (4), 1137-1143 (2015).</li>
<li>Kolia-Diafouka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Lysis-Extraction+Method+Combined+With+IS6110-Amplification+for+Detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+Paucibacillary+Sputum+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimized Lysis-Extraction Method Combined With IS6110-Amplification for Detection of Mycobacterium tuberculosis in Paucibacillary Sputum Specimens.</a> Front Microbiol. 9, 2224(2018).</li>
<li>Bonnet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Evaluation+of+GeneLEAD+VIII+DNA+Platform+Combined+to+Deeplex+Myc-TB+Assay+to+Detect+in+8+Days+Drug+Resistance+to+13+Antituberculous+Drugs+and+Transmission+of+Mycobacterium+tuberculosis+Complex+Directly+From+Clinical+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Evaluation of GeneLEAD VIII DNA Platform Combined to Deeplex Myc-TB Assay to Detect in 8 Days Drug Resistance to 13 Antituberculous Drugs and Transmission of Mycobacterium tuberculosis Complex Directly From Clinical Samples.</a> Front Cell Infect Microbiol. 11, 707244(2021).</li>
<li>Mann, B. C., et al. Systematic review and meta-analysis of protocols and yield of direct from sputum sequencing of Mycobacterium tuberculosis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMann%2C+BC+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Schwab, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+evaluation+of+nanopore+targeted+next-generation+sequencing+to+predict+drug-resistant+tuberculosis+from+native+sputum+in+South+Africa+and+Zambia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Field evaluation of nanopore targeted next-generation sequencing to predict drug-resistant tuberculosis from native sputum in South Africa and Zambia.</a> J Clin Microbiol. 63 (3), e0139024(2025).</li>
<li>Colman, R. E., Seifert, M., De la Rossa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+culture-free+targeted+next-generation+sequencing+for+diagnosing+drug-resistant+tuberculosis%3A+a+multicentre+clinical+study+of+two+end-to-end+commercial+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluating culture-free targeted next-generation sequencing for diagnosing drug-resistant tuberculosis: a multicentre clinical study of two end-to-end commercial workflows.</a> Lancet Infect Dis. 25 (3), 325-334 (2025).</li>
<li>Oberacker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-On-Magnetic-Beads+%28BOMB%29%3A+Open+platform+for+high-throughput+nucleic+acid+extraction+and+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Bio-On-Magnetic-Beads (BOMB): Open platform for high-throughput nucleic acid extraction and manipulation.</a> PLoS Biol. 17 (1), e3000107(2019).</li>
<li>Limberis, J. D., Metcalfe, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turbolysis%3A+A+low-cost%2C+small+footprint+alternative+to+commercial+bead+beaters+for+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22HardwareX%22%5BJournal%5D)">Turbolysis: A low-cost, small footprint alternative to commercial bead beaters for cell lysis.</a> HardwareX. 19, e00576(2024).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tej pracy przedstawiamy solidny, zwalidowany protokół ekstrakcji wysokiej jakości DNA M. tuberculosis za pomocą bicia kulek z magnetycznym czyszczeniem kulek do dalszych zastosowań molekularnych i NGS.
Metoda ta ma kilka zalet w porównaniu z istniejącymi protokołami ekstrakcji DNA M. tuberculosis . Podczas gdy tradycyjna ekstrakcja fenolowo-chloroformowa trwa zwykle kilka dni i wprowadza niebezpieczne chemikalia, ta metoda jest wykonywana w mniej niż 60 minut przy minimalne...

Ekstrakcja wysokiej jakości DNA z M. tuberculosis jest niezbędna do wykrywania gruźlicy lekoopornej (TB) przy użyciu ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji (NGS) i sekwencjonowania całego genomu (WGS), ale często jest pomijana. Opracowaliśmy ustandaryzowany protokół, aby zapewnić spójne, wysokiej jakości DNA do zastosowań klinicznych NGS, w tym ukierunkowanych metod NGS, takich jak Deeplex-MycTB (GenoScreen) i sekwencjonowania całego genomu, które są obecnie zalecane przez Światową Organizację Zdrowia (WHO) do diagnozowania gruźlicy lekoopornej. Warto zauważyć, że chociaż WHO zaleca te strategie diagnostyczne oparte na NGS, nie określa konkretnych protokołów ekstrakcji DNA, które je wspierają. Nasza metoda może być stosowana w testach zatwierdzonych przez WHO, a także w nowych technologiach, które wymagają wysokiej jakości DNA prątków.
Wyzwanie związane z ekstrakcją wynika z unikalnej ściany komórkowej M. tuberculosis, składającej się z kwasów mykolowych i lipidów, które sprawiają, że wyjątkowo trudno jest ją rozbić. Obecnie opublikowane roztwory ekstrakcyjne mają znaczne różnice w metodach lizy (np. Sonikacja, chemikalia, ciepło i bicie perełek) oraz metodach ekstrakcji DNA (np. ekstrakcja fenolowo-chloroformowa, wytrącanie etanolu, metody oparte na CTAB oraz na bazie kolumn i kulek), co skutkuje różnicami w wydajności, czystości i jakości DNA 1,2,3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15,16. Ponadto grupy badawcze rzadko stosują tę samą metodę ekstrakcji DNA i często mierzą sukces w różny sposób. To sprawia, że określenie, która metoda działa najlepiej, jest trudne, ponieważ optymalne podejście zależy od rodzaju zastosowania molekularnego. Na przykład rozpoznanie wariantów strukturalnych M. tuberculosis w plwocinie za pomocą sekwencjonowania z długim odczytem wymaga wyższej jakości DNA i dokładniejszej polimerazy niż uruchomienie płatnego narzędzia diagnostycznego, które celuje tylko w niewielki region rpoB. Kilka czynników dodatkowo komplikuje sukces ekstrakcji DNA. Ilość DNA, którą możemy wyekstrahować, różni się w zależności od rodzaju próbki, liczby obecnych bakterii i tego, czy istnieją substancje (współekstrahowane nieprątkowe DNA i inhibitory PCR), które zakłócają proces. Nawet aspekty techniczne, takie jak precyzja pipetowania przez technika laboratoryjnego, mogą mieć wpływ na wyniki. Obecne metody często zawodzą w przypadku przetwarzania próbek o niskim obciążeniu bakteryjnym lub wysokim poziomie zanieczyszczenia DNA, które są powszechnie spotykane w warunkach klinicznych 17,18,19.
Ubijanie koralików w niestandardowym buforze, a następnie protokół czyszczenia koralików, oferuje kluczowe zalety w porównaniu z innymi metodami. Jest to prosty i szybki przepływ pracy, który zmniejsza możliwość zmienności zależnej od operatora i utrzymuje integralność DNA w dalszych zastosowaniach NGS. To ustandaryzowane podejście jest szczególnie przydatne w laboratoriach klinicznych poszukujących wiarygodnych, powtarzalnych wyników przy użyciu zalecanych przez WHO testów oporności na leki NGS i wszystkich zastosowań WGS.

<table><tbody><tr><td>Koraliki cyrkonowo-krzemianowe 0,1 mm</td><td>Produkty Biospec</td><td>11079101z</td><td>Koraliki używane do etapu bicia koralików w celu lizy komórek mykobakteryjnych</td></tr><tr><td>Koraliki AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>Numer katalogowy A63880</td><td>Kulki magnetyczne do oczyszczania DNA po lizie</td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M, pH 8,0)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>AM9260G</td><td>Niestandardowe komponenty buforowe Triton / Low EDTA</td></tr><tr><td>Szybkie przygotowanie 24</td><td>MPbio, Stany Zjednoczone</td><td>116004500</td><td>Sprzęt do nawijania ściegu z prędkością 6,5 m/s</td></tr><tr><td>Podkład do przodu</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>Synteza niestandardowa</td><td>Sekwencja podstawowa: AATTCCTGGTGTAGCGGTGG</td></tr><tr><td>H2O (woda, klasa biologii molekularnej)</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>Zobacz materiał BP2819-1</td><td>Niestandardowe komponenty buforowe Triton / Low EDTA</td></tr><tr><td>Uniwersalna sonda Luna</td><td>Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii</td><td>Zobacz materiał M3004</td><td>Odczynnik qPCR do oznaczania DNA prątków</td></tr><tr><td>Zestaw MycoPrep</td><td>BD</td><td>SKU/REF 240863</td><td>Trawienie próbki BD MycoPrep do przetwarzania plwociny NALC-NaOH</td></tr><tr><td>NaCl (chlorek sodu, roztwór 5M)</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>Zobacz materiał AM9759</td><td>Niestandardowe komponenty buforowe Triton / Low EDTA</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Millipore Sigma</td><td>Zobacz materiał P2272 powiedział:</td><td>Przetwarzanie plwociny</td></tr><tr><td>Podkład odwrotny</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>Synteza niestandardowa</td><td>Sekwencja podstawowa: GTTTACGGCGTGGACTACCA</td></tr><tr><td>Sonda TaqMan</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>Synteza niestandardowa</td><td>Sekwencja sondy: AGGAGGAACACCGGTGGCGA</td></tr><tr><td>Tris-HCl (1M, pH 8,0)</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>AM9855G</td><td>Niestandardowe komponenty buforowe Triton / Low EDTA</td></tr><tr><td>Tryton X-100</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>28314</td><td>Niestandardowe komponenty buforowe Triton / Low EDTA</td></tr></tbody></table>

ekstrakcja dna prątków za pomocą bicia kulek w niestandardowym buforze, a następnie przepływu pracy ngs

Mycobacterial DNA Extraction using Bead Beating in Custom Buffer Followed by NGS Workflow

Gruźlica jest chorobą śmiertelną, a pojawienie się oporności na antybiotyki w czynniku wywołującym bakterię, Mycobacterium tuberculosis, pogarsza wyniki leczenia. Precyzyjna i szybka identyfikacja oporności na leki za pomocą technologii sekwencjonowania jest potrzebna do poprawy wyników leczenia pacjentów z gruźlicą dzięki dostosowanym schematom terapeutycznym. Metoda ekstrakcji DNA ma kluczowe znaczenie dla dalszych testów molekularnych i jest skomplikowana ze względu na twardą ścianę komórkową prątków, niskie obciążenie prątkami wielu próbek klinicznych oraz złożoność macierzy plwociny. Istnieje wiele doniesień o metodach ekstrakcji DNA M. tuberculosis , ale obecnie nie ma złotego standardu. Co więcej, wykazano, że niewiele z tych metod działa konsekwentnie, a wiele z nich nie nadaje się do środowisk o niskich zasobach i dużym obciążeniu gruźlicą. W związku z tym laboratoria często wprowadzają własne modyfikacje procedur, co skutkuje znaczną zmiennością metody. W tym miejscu przedstawiamy opłacalny, szybki i ustandaryzowany protokół ekstrakcji DNA Mycobacterial zarówno z plwociny klinicznej, jak i hodowli, który wytwarza DNA odpowiednie do qPCR i który powinien być rozważony do stosowania w laboratoriach diagnostyki klinicznej.

Przetestowaliśmy protokół ekstrakcji DNA zarówno na próbkach plwociny z kolcami M. tuberculosis, jak i M. tuberculosis (n = 3 dla każdego stanu). Używając hodowli M. tuberculosis H37Rv mc² 7901, znormalizowaliśmy dane wejściowe do 8,4 x 106 komórek na 50 μl, co odpowiada 1 ml hodowli MGIT przy 200 GU. W eksperymentach z plwociną pobraliśmy 1 ml plwociny pobranej od osób z chorobami układu oddechowego niezwiązanymi z gruźlicą (uzyskanymi komercyjnie) z dwoma różnymi stężeniami bakteri...

Protokół ten pokazuje, że bicie koralików w połączeniu z oczyszczaniem kulek wychwytywania DNA zapewnia szybką i spójną metodę ekstrakcji DNA z próbek Mycobacterium tuberculosis , co czyni ją skutecznym wyborem do zastosowań sekwencjonowania nowej generacji.

Ekstrakcja DNA prątków za pomocą bicia kulek w niestandardowym buforze, a następnie przepływu pracy NGS

Tuberculosis is a deadly disease, and the emergence of antibiotic drug resistance in the causative agent bacterium, Mycobacterium tuberculosis, worsens ...

Nasze badania diagnostyczne koncentrują się na poprawie wykrywania lekooporności w gruźlicy w warunkach ograniczonych zasobów, z naciskiem na szybkość i pragmatyzm. W diagnostyce gruźlicy dostępne są bardziej kompleksowe testy genotypowe, a nawet szereg nowych szybkich testów fenotypowych, a także konsekwentne dążenia do przybliżenia tych testów do punktu opieki. Istnieje jednak wiele pragmatycznych barier, które nadal istnieją.Wyzwania związane z zasobami, od odczynników, przez infrastrukturę, po logistykę, nadal stanowią poważne bariery. Ze względu na to, że wszystko wykracza poza techniczne zaawansowanie testu Cepheid Xpert, standaryzacja protokołów jest trudna w różnych warunkach. Tak więc ekstrakcja DNA MTB, jak opisano w tej pracy, jest tego doskonałym przykładem.Istnieje pilna potrzeba rozszerzenia diagnostyki gruźlicy opartej na sekwencjonowaniu, ale wielu laboratoriom nadal brakuje niezawodnego sposobu ekstrakcji wysokiej jakości DNA. Naszym celem jest udostępnienie metody, która jest prosta, praktyczna i odpowiednia dla osób pracujących w miejscu opieki nad pacjentem, w których brakuje zasobów. Tutaj przedstawiamy prosty, tani protokół przeznaczony do użytku w warunkach ograniczonych zasobów.Został zatwierdzony do zastosowań w NGS i jest kompatybilny z automatycznymi systemami obsługi cieczy. Na początek połącz roztwór chlorku sodu Bufor chlorowodorku Tris, Triton X 100 i EDTA, aby uzyskać bufor Triton. Wymieszaj mieszając i dodaj ultraczystą wodę, aby osiągnąć końcową objętość 100 mililitrów.Filtr wysterylizuj bufor przed użyciem. Następnie przygotuj 100 mililitrów buforu Tris-EDTA o niskiej zawartości EDTA, łącząc jeden mililitr jednomolowego Tris-HCl i 20 mikrolitrów 0,5-molowego EDTA. Wymieszaj i napełnij ultraczystą wodą, aby osiągnąć końcową objętość 100 mililitrów.Następnie przefiltruj bufor do sterylizacji. Aby przygotować probówki do lizy, użyj ostrza skalpela, aby ostrożnie odciąć spód 1,5-mililitrowej rurki z nakrętką tuż poniżej punktu przegięcia. Odetnij końcówkę końcówki pipety P1000 i wykonaj klin w kształcie litery V pod koniec.Wciśnij odcięty spód rurki z nakrętką w końcówkę pipety w kształcie litery V, aby uformować miarkę. Napełnij sterylny pojemnik 0,1-milimetrowymi kulkami krzemianu cyrkonu. Za pomocą przygotowanej miarki przenieś około 200 miligramów kulek do 1,5-mililitrowych tubek z nakrętką.W celu przygotowania hodowli komórek bakteryjnych przenieś pięć mililitrów kultury Mycobacterium tuberculosis do 15-mililitrowej stożkowej probówki wirówkowej. Wirować z maksymalną prędkością przez 10 minut. Teraz użyj 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby ostrożnie usunąć wszystko, z wyjątkiem około 500 mikrolitrów supernatantu, nie naruszając osadu.Użyj pipety P1000, aby usunąć pozostały supernatant. Ponownie zawiesić osad w 350 mikrolitrach niestandardowego bufora trytonowego, a następnie dobrze wymieszać, pipetując w górę iw dół. Podgrzewać próbkę w suchej łaźni cieplnej przez 30 minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza.Aby przygotować plwocinę, przenieś od jednego do pięciu mililitrów próbki plwociny do sterylnej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Aby przeprowadzić upłynnianie ditiotreitolu, dodaj cztery objętości 10-milimolowego ditiotreitolu do próbki plwociny, a następnie dokładnie wiruj przez 30 sekund. Odwirować próbkę z maksymalną prędkością przez 10 minut.Następnie użyj 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby wyrzucić wszystkie oprócz 500 mikrolitrów supernatantu. Usunąć resztę supernatantu za pomocą pipety P1000, nie naruszając osadu. Ponownie zawiesić pelety w 350 mikrolitrach niestandardowego bufora trytonowego.Aby przeprowadzić skraplanie wodorotlenku sodu NALC, należy dodać cztery objętości roztworu wodorotlenku sodu NALC do próbki plwociny. Mieszaj mieszaninę przez 30 sekund. Następnie inkubuj probówkę przez siedem minut w temperaturze pokojowej.Teraz dodaj PBS do znaku 50 mililitrów. Zwiruj zawartość probówki, aby dobrze się wymieszała, a następnie odwiruj probówkę z maksymalną prędkością przez 10 minut. Po odwirowaniu za pomocą 50-mililitrowej pipety serologicznej wyrzucić supernatant, jak pokazano wcześniej.Następnie ponownie zawieś granulat w 350 mikrolitrach niestandardowego bufora trytonowego. Najpierw przenieś 350 mikrolitrów inaktywowanej próbki do oznakowanej 1,5-mililitrowej rurki z nakrętką zawierającą 250 mikrolitrów 0,1-milimetrowych kulek krzemianu cyrkonu. Bead pokonywał lizat z prędkością 6,5 metra na sekundę przez 45 sekund z dwiema minutami przerwy między cyklami.Odwirować próbkę z maksymalną prędkością przez dwie minuty, a następnie przenieść 150 mikrolitrów supernatantu do nowej, oznakowanej probówki. Następnie wyczyść wirowo kulki magnetyczne, które zostały zrównane w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby je ponownie zawiesić. Przenieś 180 mikrolitrów kulek magnetycznych do próbki DNA.Pipetować w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać. Po dwuminutowej inkubacji w temperaturze pokojowej umieść probówkę na stojaku magnetycznym i odczekaj dwie minuty, aż roztwór się klaruje. Następnie użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby wyrzucić supernatant.Trzymając rurkę nadal na stojaku magnetycznym, dodaj 500 mikrolitrów świeżo przygotowanego 70% etanolu wzdłuż przeciwległej ściany i odczekaj 30 sekund. Pod koniec ostatniego prania usuń resztki etanolu za pomocą pipety o pojemności 10 mikrolitrów i wysusz na powietrzu przez dwie minuty. Gdy tylko koraliki staną się nieprzezroczyste, wyjmij rurkę ze stojaka magnetycznego.Zawiesić ponownie w 20 mikrolitrach buforu Tris o niskiej zawartości EDTA. Wymieszać przez pipetowanie lub wirowanie, aby upewnić się, że wszystkie kulki są w roztworze przed pięciominutową inkubacją w temperaturze pokojowej. Następnie umieść probówkę na stojaku magnetycznym na dwie minuty, aż będzie czysta.Następnie przenieś mniej niż 20 mikrolitrów wymytego DNA do nowej znakowanej probówki, aby uniknąć przeniesienia kulek. Aby określić ilościowo DNA prątków za pomocą ilościowego PCR ukierunkowanego na 99 nukleotydów prątkowego atpE, należy złożyć główną mieszankę QPCR na lodzie. Dostosuj mieszankę wzorcową w zależności od ilości próbek i wzorców, w tym 10% nadwyżki w celu uwzględnienia strat związanych z pipetowaniem.Uruchom termocykler w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 60 sekund, a następnie wykonaj 35 cykli w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 sekund i 60 stopni Celsjusza przez 30 sekund z szybkością narastania 2,11 stopnia Celsjusza na sekundę. Uruchom wszystkie próbki, wzorce i kontrole w trzech egzemplarzach. W tym przypadku hodowle prątków gruźlicy wykazały najwyższe stężenia DNA spośród wszystkich badanych schorzeń.Próbki plwociny z kolcami wykazywały stopniowo niższą wydajność DNA i zwiększoną zmienność wraz ze zmniejszaniem się wkładu bakterii, szczególnie w grupie 10 000 bakterii.

mycobacterial-dna-extraction-using-bead-beating-custom-buffer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Przedstawiono porównanie i optymalizację dwóch metod wzbogacania DNA organelek roślinnych: tradycyjne wirowanie różnicowe i frakcjonowanie całkowitego gDNA w oparciu o status metylacji. Oceniamy otrzymaną ilość i jakość DNA, wykazujemy wydajność w sekwencjonowaniu nowej generacji z krótkim odczytem i omawiamy potencjał zastosowania w sekwencjonowaniu pojedynczych cząsteczek z długim odczytem.

Optymalizacja i analiza porównawcza metod wzbogacania organelek DNA roślin odpowiednich do sekwencjonowania nowej generacji

Technologia nanoporowa do sekwencjonowania biomolekuł ma szerokie zastosowanie w naukach przyrodniczych, w tym do identyfikacji patogenów, monitorowania bezpieczeństwa żywności, analizy genomicznej, metagenomicznego monitorowania środowiska i charakterystyki oporności bakterii na antybiotyki. W artykule przedstawiono procedurę metagenomicznego sekwencjonowania DNA gleby w celu identyfikacji gatunków z wykorzystaniem technologii sekwencjonowania nanoporowego.

Sekwencjonowanie DNA w nanoporach do metagenomicznej analizy gleby

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania danych o sekwencji amplikonów mikrobiomów gleby, ryzosfery i korzeni. Informacje te mogą być wykorzystane do zbadania składu i różnorodności zbiorowisk mikrobiologicznych związanych z roślinami i nadają się do stosowania w odniesieniu do szerokiej gamy gatunków roślin.

Badanie mikrobiomu korzeni: ekstrakcja danych o społeczności bakteryjnej z gleby, ryzosfery i endosfery korzeni

Długie sekwencje znacznie ułatwiają tworzenie złożonych genomów i charakteryzację zmienności strukturalnej. Opisujemy metodę generowania ultradługich sekwencji za pomocą platform sekwencjonowania opartych na nanoporach. Podejście to wykorzystuje zoptymalizowaną ekstrakcję DNA, a następnie zmodyfikowane przygotowania biblioteczne w celu wygenerowania setek odczytów kilobazowych z umiarkowanym pokryciem z komórek ludzkich.

Sekwencjonowanie z bardzo długim odczytem do analizy całego genomu DNA

Opisana tutaj jest uproszczona standardowa procedura operacyjna do profilowania mikrobiomu przy użyciu sekwencjonowania metagenomicznego 16S rRNA i analizy przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi. Protokół ten pomoże naukowcom, którzy są nowicjuszami w dziedzinie mikrobiomu, a także tym, którzy potrzebują aktualizacji metod osiągania profilowania bakteryjnego w wyższej rozdzielczości.

Analiza mikrobioty za pomocą dwuetapowej reakcji PCR i sekwencjonowania genów 16S rRNA nowej generacji

Opisany tutaj jest protokół ekstrakcji DNA z wykorzystaniem kulek magnetycznych do produkcji wysokiej jakości ekstrakcji DNA od komarów. Ekstrakcje te są odpowiednie dla dalszego podejścia do sekwencjonowania nowej generacji.

Protokół ekstrakcji DNA komarów oparty na kulkach magnetycznych do sekwencjonowania nowej generacji

Ekspresja genów jest regulowana przez interakcje promotorów genów z dystalnymi elementami regulatorowymi. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób niski poziom wejściowy Capture Hi-C (liCHi-C) pozwala na identyfikację tych interakcji w rzadkich typach komórek, które wcześniej były niemierzalne.

Zintegrowany proces pracy do badania architektury genomu czasoprzestrzennego skoncentrowanej na promotorze w rzadkich populacjach komórek

Przedstawiamy zoptymalizowaną metodę ekstrakcji DNA z odkażonej plwociny przy użyciu metody ekstrakcji opartej na matrycy w połączeniu z oczyszczaniem kulek magnetycznych w celu dalszego ukierunkowanego sekwencjonowania Mycobacterium tuberculosis.

Ekstrakcja DNA oparta na matrycy do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji na odkażonych próbkach plwociny

Protokół ten opisuje metodę CTAB polegającą na wydobyciu wysokiej jakości DNA z mykobakterii, pokonując wyzwania związane z ich twardymi, bogatymi w kwas grzybniczy ściany komórkowe. Proces obejmuje trawienie enzymatyczne, lizę komórek za pomocą CTAB oraz oczyszczanie DNA poprzez ekstrakcję organiczną i wytrącanie etanolem. Ta metoda wytwarza DNA odpowiednie do badań molekularnych i jest wiarygodna w badaniach mykobakterialnych.

Ekstrakcja deoksyrybonukleinowym w całym genomie z gatunków Mycobacterium za pomocą techniki bromku cetylotrymetylamoniowego

W tym miejscu przedstawiamy protokół umożliwiający sekwencjonowanie całego genomu bakteryjnych infekcji przenoszonych drogą płciową z próbek klinicznych przy użyciu wzbogacania docelowego. Ta nowatorska, panelowa metoda syndromiczna pozwala przezwyciężyć wyzwania związane z obfitością ludzkiego DNA i niskim obciążeniem bakteryjnym, ułatwiając nadzór genomiczny nad Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum i Mycoplasma genitalium.

Generowanie całych genomów bakteryjnych z próbek klinicznych przy użyciu przepływu pracy wzbogacania celu

Obecne badanie opisuje przepływ pracy dla sekwencjonowania nanoporami plazmidów, gdy sekwencja chromosomowa jest już znana lub nie jest istotna. Początkowy krok wzbogacania DNA plazmidowego zapewnia optymalną głębokość sekwencji plazmidu i maksymalizuje liczbę próbek, które mogą być sekwencjonowane na jednej komórce przepływowej.

Sekwencjonowanie i montaż długich plazmidów za pomocą przepływów opartych na sekwencjonowaniu Nanopore

Poznaj szybką ekstrakcję DNA z Mycobacterium tuberculosis metodą bicia kulek i oczyszczania na kulkach magnetycznych. Protokół zapewnia wysokie plony DNA kompatybilne z sekwencjonowaniem NGS w warunkach ograniczonych zasobów.

Ekstrakcja DNA prątków za pomocą bicia kulek w niestandardowym buforze, a następnie przepływu pracy NGS

Przeglądaj więcej filmów