Name: In Vivo Obrazowanie ujawnia migracyjne zachowanie leukocytów w stawach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Poznaj technikę obrazowania in vivo stawów myszy w modelu CIA, aby badać migrację leukocytów i dynamikę molekularną w zapaleniu. Metoda umożliwia wizualizację komórek immunologicznych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Działalność Y.M. jest wspierana przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) KAKENHI [grant numer JP22K08531, JP25K02574]; Japońska Agencja ds. Badań i Rozwoju Medycznego (AMED) [Grant Number: 25bm1423033]; Fundacja Pamięci Mochidy na rzecz Badań Medycznych i Farmaceutycznych; Grant JCR na wspieranie badań dla FRONTIER oraz Fundacji Mitsubishi.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Instytucjonalnej Wydziału Medycznego Uniwersytetu św. Marianny (Nr Zatwierdzenia TG240926-2 i TG250801-2) i przeprowadzane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i krajowymi.
1. Przygotowanie modelu myszego zapalenia stawów
UWAGA: Modele zwierzęce artretyzmu dostarczyły cennych narzędzi do zrozumienia patogenezy choroby oraz do opracowywania nowych terapii14. Chociaż kilka myszych modeli artretyzmu ma unikalne zalety i ograniczenia, zapalenie stawów wywołane kolagenem typu II (CIA) było szeroko wykorzystywane w badaniach nad patogenezą reumatoidalnego zapalenia stawów (RA)14. W tej sekcji opisujemy protokół modeli CIA dotyczący artretyzmu (materiały i instrumenty pokazano na Rysunku 1).
<ol>
	<li>Przygotuj rozcieńczenie kolagenu typu II bydłego w stężeniu 0,05 M kwasu octowego (końcowe stężenie 4 mg/mL) poprzez potrząsanie przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Aby uzyskać emulsję, wymieszaj rozcieńczenie kolagenu (4 mg/mL w kwasie octowym 0,05 M) z kompletnym adiuwantem Freunda (CFA) w proporcji 1:1 w szklanej strzykawce. Daje to końcowe stężenie kolagenu w emulsji wynoszącą 2 mg/mL. Energicznie mieszaj ręcznie przez około 20 minut. Proces ten generuje ciepło, więc schładz szklaną strzykawkę zawierającą emulsję na lodzie. Użyj zlewki, aby sprawdzić konsystencję emulsji podczas przygotowania. UWAGA. Resztki rozcieńczenia kolagenu przechowywać w temperaturze -80 °C. Można to wykorzystać podczas drugiego szczepienia.</li>
	<li>Przelej emulsję do szklanej strzykawki o pojemności 1 mL wyposażonej w igłę 26 x 1/2 G i trzymaj ją na lodzie aż do szczepienia.</li>
	<li>Znieczulać 8-tygodniowe myszy DBA1/J (męskie lub żeńskie) za pomocą dootrzewnowych zastrzyków medetomidyny (0,3 mg/kg), midazolamu (4 mg/kg) oraz wetorfalu (5 mg/kg). UWAGA. Myszy transgeniczne często mają tło C57BL6. Kolagen kurczaka jest zazwyczaj stosowany w CIA u myszy C57BL6; jednak częstość występowania i nasilenie CIA u myszy C57BL6 są niższe niż u myszy DBA/1J. Jeśli używasz myszy transgenicznych na tle C57BL6, rozważ przeprowadzenie badania pilotażowego w celu oceny zachorowalności i nasilenia CIA.</li>
	<li>Ogol włosy wokół ogona za pomocą maszynki do przygotowań do szczepień.</li>
	<li>Powoli wstrzykuj 100 μL objętości emulsji (zawierającej 200 μg kolagenu) do przestrzeni podskórnej wzdłuż grzbietu ogonowego (blisko nasady ogona) (Rysunek 2).</li>
	<li>Powtórz kroki od 1,2 do 1,6 w dniu 21 dla drugiego szczepienia (Rysunek 2).</li>
</ol>
2. Ocena klinicznej oceny artretyzmu oraz pomiar grubości łapy
UWAGA: Kliniczne oceny artretyzmu oraz pomiar grubości łapy są niezbędne do oceny aktywności chorobowej. Zazwyczaj kliniczne wyznaczanie i pomiary grubości łapy w przypadku artretyzmu wykonuje się co 1-3 dni po pierwszym szczepieniu.
<ol>
	<li>Kliniczny wynik artretyzmu: Zapisz sumę wyników dla wszystkich czterech łap każdej myszy. Stosuj następujący system punktacji: 0 = Normalne 1 = Rumień i obrzęk jednego palca 2 = Rumień i obrzęk dwóch palców lub rumień oraz obrzęk stawu skokowego 3 = Rumień i obrzęk powyżej trzech palców lub obrzęk dwóch palców i stawów kostkowych 4 = Rumienie i poważne obrzęk kostki, stopy i palców z deformacją. UWAGA. Spuchnięty staw kostkowy definiuje się jako grubość łapy większej niż 4 mm.</li>
	<li>Pomiar grubości łapy: Zmierz grubość każdej łapy za pomocą cyfrowych zacisków przesuwanych. Użyj średniej grubości łapy na wszystkich czterech łapach każdej myszy.</li>
</ol>
3. Obrazowanie stawów in vivo
UWAGA: Obrazowanie stawów in vivo pozwala obserwować migrację leukocytów do stawów oraz analizować ich zachowanie w tkance u żywych myszy. Do wizualizacji komórek używa się myszy transgenicznych genetycznie zmodyfikowanych do ekspresji fluorescencyjnej białek w określonych komórkach, a także myszy dożylnie wstrzykiwanych przeciwciałami markerowymi przeciwkomórkowymi. Użyte materiały przedstawiono na Rysunku 3.
<ol>
	<li>Znieczulanie myszy artrytoogennych podaj dootrzewnowkowo za pomocą medetomidyny (0,3 mg/kg), midazolamu (4 mg/kg) oraz wetorfalu (5 mg/kg).</li>
	<li>Ogol nogę myszy maszynką do cięcia i użyj kremu do usuwania włosów (<60 s), aby usunąć pozostałe włosy. Unikaj długotrwałego nakładania, aby zapobiec podrażnieniom skóry.</li>
	<li>Usuń krem wilgotną gazą (rysunek 4A). Upewnij się, że wszystkie włosy są usunięte, aby uniknąć niepożądanej autofluorescencji w obszarze obrazowania. Powtórz, jeśli trzeba.</li>
	<li>Podczas znieczulenia na oba oczy nakłada się sterylny lubrykant do rogówki, aby zapobiec wysychaniu rogówki lub owrzodzeniom.</li>
	<li>Pod mikroskopem chirurgicznym wykonaj nacięcie o średnicy 1 cm na skórze za pomocą mikronożyczek (Rysunek 4B). UWAGA. Ten krok jest kluczowy. Operacja może wywołać rekrutację leukocytów (zwłaszcza neutrofilowych). Unikaj wszelkich obrażeń, które mogłyby powodować artefakty. Z powodu angiogenezy stawów artretycznych, te stawy są podatne na krwawienie. Do udanej operacji może być potrzebnych wiele sesji ćwiczeń.</li>
	<li>Umieść stawy artretyczne na plastikowej płycie (rysunek 4C). UWAGA. Klej tkankowy może być użyty, aby pomóc utrzymać nogę myszy na miejscu. W tym badaniu używa się gliny do przymocowania szklanej szkiełki do plastikowej płyty.</li>
	<li>Pokryj obszar obrazowania około 1 mL agarozy o stężeniu 1,5% z fosforanem buforowanym solą fizjologiczną (PBS) (Rysunek 4D). UWAGA. Upewnij się, że agaroza ostygła, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek, co może sprzyjać rekrutacji leukocytów do obszaru obrazowania.</li>
	<li>Ustaw scenę pod mikroskopem. UWAGA. Używaj poduszki grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała myszy podczas dłuższych sesji obrazowania.</li>
	<li>Dostosuj ustawienia mikroskopu konfokalnego (moc lasera, wzmocnienie, przesunięcie, położenie itd.). Tutaj wykonaj obrazowanie mikroskopem konfokalnym z obiektywem zanurzającym 25 osób, NA 1.1. Ustaw wzbudzenie lasera na 488 nm, 561 nm i 640 nm, a emisję zbieraj na 488,0 nm, 561,6 nm i 638,5 nm.<ol>
		<li>Sprawdź szybkość badania mikroskopu. Użyj rozdzielczości pikseli 512 x 512, z 5 przekrojami optycznymi, stosem Z o średnicy 4 μm oraz czasem cyklu 15 s, aby umożliwić analizę poszczególnych komórek ruchomych w odpowiednim czasie i uzyskanie istotnych danych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy odpowiednie miejsce zostanie zidentyfikowane, rozpocznij akwizycję obrazu. UWAGA. Jeśli używasz przeciwciał markerowych antykomórkowych do znakowania leukocytów, wstrzyknij przeciwciała dożylnie 3 minuty przed rozpoczęciem obrazowania. Dla wizualizacji naczyń krwionośnych wstrzykuj jednocześnie Qdots, przeciwciało CD31 lub Dekstern. Na przykład należy wstrzyknąć około 2 μg przeciwciał na mysz Ly6G dla neutrofilów i CD4 dla limfocytów T, a także około 80 μg 680-250k Dekstranu na mysz do barwienia naczyń krwionośnych. Przeciwciała i Dextran są zwykle rozpuszczane w 100 μL bezpłodnego PBS. Pamiętaj, że niektóre przeciwciała mogą wyczerpywać leukocyty, więc sprawdź, czy wybrane przeciwciała nie zmniejszają liczby leukocytów.</li>
	<li>Przetworz obrazy ND2 uzyskane mikroskopem konfokalnym przy użyciu modułu General Analysis 3 (GA3) oprogramowania do analizy obrazów NIS-Elements (wersja 6.20.00). Wykonaj usunięcie obszarów naczyniowych i odejmowanie tła. Po przetworzeniu wszystkich ram czasowych eksportuj obrazy jako wideo. UWAGA. W ramach analizy policz liczbę komórek przyklejających i wyekstrawazowanych.</li>
	<li>Po zakończeniu badania obrazowego można pozwolić zwierzęciu na regenerację jako procedurę przetrwania lub humanitarnie je uśpić, w zależności od projektu eksperymentalnego. Jeśli planowane jest przeżycie, delikatnie zamknąć miejsce operacji i zapewnić odpowiednią opiekę pooperacyjną zgodnie z wytycznymi instytucjonalnej opieki nad zwierzętami. UWAGA: W tym badaniu wszystkie zwierzęta zostały humanitarnie uśpione natychmiast po badaniach obrazowych, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i krajowymi.</li>
</ol>
4. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Przedstawij dane jako średnią ± błędu standardowego średniej (SEM). Przeprowadź analizę statystyczną za pomocą testu Student's t dla porównań dwóch grup lub jednokierunkowego ANOVA dla wielu grup, a następnie test post hoc Tukeya. Za statystycznie istotną rozważmy wartość p < 0,05. UWAGA: Cała analiza została przeprowadzona przy użyciu GraphPad Prism w wersji 10.</li>
</ol>

<ol><li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+migration+into+inflamed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Leukocyte migration into inflamed tissues.</a> Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).</li>
<li>Miyabe, Y., Lian, J., Miyabe, C., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+in+rheumatic+diseases%3A+pathogenic+role+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Chemokines in rheumatic diseases: pathogenic role and therapeutic implications.</a> Nat Rev Rheumatol. 15 (12), 731-746 (2019).</li>
<li>Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+chemokine+receptors%3A+positioning+cells+for+host+defense+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity.</a> Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).</li>
<li>Murooka, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-infected+T+cells+are+migratory+vehicles+for+viral+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HIV-infected T cells are migratory vehicles for viral dissemination.</a> Nature. 490 (7419), 283-287 (2012).</li>
<li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427 (6970), 154-159 (2004).</li>
<li>Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%3A+visualizing+immunity+in+context%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy: visualizing immunity in context.</a> Immunity. 21 (3), 315-329 (2004).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+function+and+fate+of+neutrophils+in+sterile+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair.</a> Science. 358 (6359), 111-116 (2017).</li>
<li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).</li>
<li>Miyabe, Y., Kim, N. D., Miyabe, C., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+chemokine+control+of+neutrophil+migration+in+vivo+in+a+murine+model+of+inflammatory+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Studying chemokine control of neutrophil migration in vivo in a murine model of inflammatory arthritis.</a> Methods Enzymol. 570, 207-231 (2016).</li>
<li>Miyabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+C5a+receptor+is+the+key+initiator+of+neutrophil+adhesion+igniting+immune+complex-induced+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Complement C5a receptor is the key initiator of neutrophil adhesion igniting immune complex-induced arthritis.</a> Sci Immunol. 2 (7), eaaj2195(2017).</li>
<li>Sadik, C. D., Miyabe, Y., Sezin, T., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+critical+role+of+C5a+as+an+initiator+of+neutrophil-mediated+autoimmune+inflammation+of+the+joint+and+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">The critical role of C5a as an initiator of neutrophil-mediated autoimmune inflammation of the joint and skin.</a> Semin Immunol. 37, 21-29 (2018).</li>
<li>Miyabe, Y., Miyabe, C., Mani, V., Mempel, T. R., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+complement+receptor+C5aR2+transports+C5a+to+initiate+neutrophil+adhesion+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Atypical complement receptor C5aR2 transports C5a to initiate neutrophil adhesion and inflammation.</a> Sci Immunol. 4 (35), eaav5951(2019).</li>
<li>Kohl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Igniting+the+flame+in+arthritis%3A+C5aR2+controls+endothelial+transcytosis+of+C5a%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Igniting the flame in arthritis: C5aR2 controls endothelial transcytosis of C5a.</a> Sci Immunol. 4 (35), eaax0352(2019).</li>
<li>Miyabe, Y., Miyabe, C., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LTB4+and+BLT1+in+inflammatory+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">LTB4 and BLT1 in inflammatory arthritis.</a> Semin Immunol. 33, 52-57 (2017).</li>
<li>Miyabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necessity+of+lysophosphatidic+acid+receptor+1+for+development+of+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Necessity of lysophosphatidic acid receptor 1 for development of arthritis.</a> Arthritis Rheum. 65 (8), 2037-2047 (2013).</li>
</ol>

Y.M. otrzymała wsparcie grantowe/badawcze od Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.

Obrazowanie stawów in vivo, w przeciwieństwie do tradycyjnych badań końcowych, dostarcza bezprecedensowych informacji o dynamicznych procesach biologicznych u żywych myszy. Na przykład ta technika pozwala nam zrozumieć, jak cztery różne receptory chemoatraktantów – C5aR1, BLT1, CCR1 i CXCR2 – współpracują, aby zainicjować rekrutację neutrofili do zapalnych stawów w artretyzmie10,11. Dodatkowo, obrazowanie in vivo ujawniło nowatorską funkcjonalną...

Ponieważ leukocyty są komórkami przenoszonymi przez krew pochodzącymi ze szpiku kostnego, muszą przenikać do tkanek, aby wywołać stan zapalny1. Kontrola tego procesu stanowi kluczowy moment, w którym można opracować nowe terapie łagodzące stan zapalny2. Ogólnie rzecz biorąc, transport leukocytów do tkanek zapalnych zachodzi w żyłkach ponaczynowych i następuje po kaskadzie adhezji, zaczynając od wychwytywania wolno przepływających leukocytów przez ścianę naczynia. Ponadto proces ten jest następujący, gdy leukocyty toczą się wzdłuż ściany naczynia w kierunku przepływu, zatrzymują się na śródbłonku, uwalniają się od zrzażenia oraz pełzają we wszystkich kierunkach po powierzchni naczynia, aby znaleźć miejsce recepcyjne do migracji śródbłonka (TEM) do konkretnego miejsca w tkance 1,3.
Te wyraźne etapy są regulowane kombinacją sygnałów molekularnych, w tym selektynów (do toczania), integrinów (do zatrzymania, pełzania) oraz chemoatraktantów (CAs) (do zatrzymania, możliwego pełzania i TEM)3. CA aktywują leukocyty za pośrednictwem siedmiu transbłonowych receptorów chemoatraktantów sprzężonych z białkiem G (CAR) i odgrywają kluczową rolę w kaskadzie adhezji, zwiększając afinitet integrinowy (prowadząc do zatrzymania przyrostów) i indukując TEM. Jednak dokładne mechanizmy TEM nie są w pełni poznane. Tradycyjne badania końcowe oraz eksperymenty in vitro nie dostarczyły wglądu w to, jak sygnalizacja CA-CAR dynamicznie reguluje migracyjne zachowania leukocytów in vivo.
Najnowsze postępy w technologii obrazowania dostarczyły bezprecedensowych wglądów w migrację komórek odpornościowych u żywych zwierząt, znacznie pogłębiając nasze zrozumienie molekularnej regulacji handlu komórkami odpornościowymi in vivo 4,5,6.Na przykład ta technologia wyjaśniła molekularną kontrolę transportu neutrofili do miejsc zapalenia tkanek, takich jak termiczne uszkodzenie wątroby7 czy laserowe uszkodzenie skóry8. Dlatego złożyliśmy wniosek o zbadanie molekularnych mechanizmów kontrolujących transport neutrofili do miejsc zapalenia stawów9. Opisane tutaj obrazowanie stawów in vivo wykazało, że komponent komplementowy C5a receptor 1 (C5aR1) jest kluczowy dla inicjowania przyczepności neutrofili do śródbłonka stawowego, wywołując stan zapalny w stawach. C5aR1 ułatwiał zatrzymanie i rozprzestrzenianie się neutrofili zależne od integriny, po czym nastąpił TEM pośredniczony przez leukotrienowy receptor B4 oraz pełzanie wywołane przez CC chemokinowy receptor 1 (CCR1). Receptor chemokinowy CXC 2 (CXCR2) odegrał rolę w późniejszych stadiach TEM neutrofili w stanach zapalnychstawów 10. Ponadto obrazowanie stawów in vivo ujawniło nowy paradygmat reakcji nadwrażliwości typu III w stawie, gdzie C5a inicjuje stan zapalny, podczas gdy komórki mieszkające w tkankach odgrywają ważniejszą rolę w zapaleniu w obecnym paradygmacie reakcji nadwrażliwości typu III10,11.
Ponadto zastosowaliśmy obrazowanie in vivo stawu, aby zbadać dynamikę molekularną C5a w jego obrębie. C5a załadowany na tkankę stawową u myszy typu dzikiego był szybko transportowany do światła naczyniowego, natomiast u myszy z niedoborem C5aR2 C5a pozostawał całkowicie w tkancemaziowej12. Dane te pokazują, że C5aR2, wyrażany na śródbłonku stawów, transportuje C5a do lumenu naczynia, co jest procesem niezbędnym dla zrostów neutrofili zależnych od C5aR1 w stawach13.
Obrazowanie stawów in vivo ma zastosowanie we wszystkich modelach zapalnego zapalenia stawów i pozwala na długoterminową obserwację (zwykle kilka godzin), choć wizualizacja głębokiej tkanki (>1 mm) może być ograniczona w zależności od użytego mikroskopu. Łącznie ta technika stanowi potężne narzędzie do badania migracyjnego zachowania leukocytów oraz dynamiki molekularnej w obrębie zapalonych stawów. Udostępniamy ten protokół do obrazowania stawów in vivo, aby wspierać grupy badawcze badające ten proces w stanie zapalnym stawów.

<table><tbody><tr><td>29 G x 1/2"</td><td>Terumo</td><td>SS-10M2913</td><td></td></tr><tr><td>0,1 M kwasu octowego</td><td>Fujifilm</td><td>016-18835</td><td></td></tr><tr><td>1 mL plastikowej strzykawki</td><td>Do góry</td><td>19531</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 mm na smar</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>18 G x 1 1/2"</td><td>Terumo</td><td>NN-1838R</td><td></td></tr><tr><td>26 G x 1/2"</td><td>Terumo</td><td>NN-2613S</td><td></td></tr><tr><td>680-250 kDa dextran</td><td>Biot</td><td>80135</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>invitrogen</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen typu II bydła</td><td>Centrum Badań nad Kolagenem</td><td>K42</td><td></td></tr><tr><td>Glina</td><td>Debika</td><td>93186</td><td></td></tr><tr><td>Totalny fanatyk s adjuvant (CFA)</td><td>Chondrex</td><td>7001</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Nikon</td><td>A1</td><td></td></tr><tr><td>Szkło okładkowe</td><td>Matsunami Glass IND.,Ltd</td><td>C024401</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy zacisk suwakowy</td><td>Mitsutoyo</td><td>500-180-30</td><td></td></tr><tr><td>Rurka Falcon (15 mL)</td><td>Corning</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Rurka Falcon (50 mL)</td><td>Corning</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwmysie Ly6G sprzężone z FITC</td><td>Biolegenda</td><td>127606</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Roboz</td><td>RS-5070</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>NAPOX</td><td>MA-48-2</td><td></td></tr><tr><td>Szklana strzykawka i złącze</td><td>Tsubasa Industry Co., Ltd&nbsp;</td><td>S7P</td><td></td></tr><tr><td>Smar</td><td>Silikon Toray Dow Corning</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Obcinaczka do włosów</td><td>Wahl</td><td>WA5109</td><td></td></tr><tr><td>Obcinaczka do włosów</td><td>Wahl</td><td>9966</td><td></td></tr><tr><td>Usuwanie owłosienia cr&egrave; Ja</td><td>Kracie</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Medetomidyna</td><td>Meiji</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Mikronożyczki</td><td>Roboz</td><td>RS-5610</td><td></td></tr><tr><td>Mikronożyczki</td><td>Roboz</td><td>RS-5630</td><td></td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>Sandoz</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Wilgotna gaza</td><td>Nippon Paper Crecia Co., Ltd</td><td>S-200</td><td></td></tr><tr><td>Analiza obrazów NIS-Elements 6.20.00</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>PBS w tubie Falcon (50 mL)</td><td>Shimadzu Diagnostics Corporation</td><td>5913</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało CD4 sprzężone z mieszanką PE przeciwko myszom</td><td>Biolegenda</td><td>100408</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa płytka</td><td>Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Prism 10.3.1</td><td>GraphPad</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Szkło przesuwkowe</td><td>Muto Pure Chemicals Co., Ltd</td><td>5115</td><td></td></tr><tr><td>Zakres chirurgiczny</td><td>Olympus</td><td>VMZ</td><td></td></tr><tr><td>Wiązanie tkankowe</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Vetorphale&nbsp;</td><td>Meiji</td><td>Nie ma</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo obrazowanie ujawnia migracyjne zachowanie leukocytów w stawach

In Vivo Imaging Uncovers the Migratory Behavior of Leukocytes within the Joints

Leukocyty to komórki przenoszone przez krew pochodzące ze szpiku kostnego, które muszą migrować do tkanek, aby pośredniczyć w stanie zapalnym. Kontrola tej migracji stanowi zatem kluczowy punkt dla opracowania nowych strategii terapeutycznych łagodzących stan zapalny. Tradycyjne badania końcowe nie pozwoliły nam w pełni rozłożyć na czynniki pierwsze migracyjne zachowania leukocytów in vivo. Najnowsze osiągnięcia w technologii obrazowania dostarczyły jednak bezprecedensowych informacji na temat migracji komórek odpornościowych u żywych zwierząt, znacznie pogłębiając naszą wiedzę o molekularnej regulacji handlu komórkami odpornościowymi. 
Przedstawiamy szczegółowy protokół obrazowania stawów in vivo z wykorzystaniem modelu zapalenia stawów typu II (CIA) typu myszy. Myszy są szczepione kolagenem typu II emulgowanym w kompletnym adiuwantie Freunda, a postęp artretyzmu jest monitorowany za pomocą klinicznych pomiarów i grubości łap. W szczytowym stadium artretyzmu leukocyty są wizualizowane in vivo za pomocą mikroskopii konfokalnej u myszy transgenicznych wyrażających białka fluorescencyjne lub u myszy typu dzikiego po dożylnym wstrzyknięciu fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał oraz wysokomolekularnego dektranu do barwienia naczyń. Staranna chirurgiczna ekspozycja stawu, aplikacja agarozy oraz prawidłowe ustawienie nogi pozwalają na stabilne, długotrwałe obrazowanie, zwykle trwające kilka godzin. Takie podejście umożliwia analizę w czasie rzeczywistym zatrzymania leukocytów, pełzania i migracji przezendothelium w obrębie zapalnych stawów. 
Protokół ten będzie cenny dla grup badawczych zajmujących się handlem leukocytami w chorobach artretyzmu i innych chorobach zapalnych. Może również służyć jako platforma do przedklinicznej oceny terapii ukierunkowanych na migrację komórek odpornościowych.

Tutaj 8-tygodniowe samce myszy DBA/1J są szczepione emulsją zawierającą kolagen typu II i CFA bydła w proporcji 1:1 w dniu 0 i 21. Kliniczne punktowanie i pomiary grubości łapy w przypadku artretyzmu wykonuje się co 1-3 dni między dniem 0 a 42. Zazwyczaj początek artretyzmu obserwuje się około 28. dnia, a wynik kliniczny artretyzmu i grubość łapy osiągają szczyt około 35. dnia (rysunek 5A-C). Częstość występowania CIA u myszy DBA/1J zwykle przekracza 90-100%...

Obrazowanie stawów in vivo to cenna technika wykrywająca migracyjne zachowania leukocytów oraz dynamikę molekularną w obrębie zapalonych stawów. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół obrazowania stawów in vivo z wykorzystaniem modelu myszego zapalenia stawów wywołanego kolagenem II (CIA).

In Vivo Obrazowanie ujawnia migracyjne zachowanie leukocytów w stawach

Leukocytes are blood-borne cells derived from the bone marrow that must migrate into tissues to mediate inflammation. Controlling this migration, ...

Ponieważ komórki krwi leukocytów pochodzą z szpiku kostnego, muszą przenikać do tkanek, aby wywołać stan zapalny. Kontrola tego procesu stanowi kluczowy punkt, w którym można opracować nowe terapie łagodzące stan zapalny. Ogólnie rzecz biorąc, transport leukocytów do tkanek zapalnych odbywa się w żyłkach ponaczynkowych i następuje po kaskadzie adhezji, która zaczyna się od wychwytu wolno przepływającego leukocytu przez ścianę naczynia.Następnie toczy się wzdłuż ściany statku w kierunku pro. Zatrzymanie śródbłonka. Jest to od adhezji i pełzania we wszystkich kierunkach po powierzchni naczynia, aby znaleźć odpowiednie miejsce i przenieść się do konkretnego miejsca w tkance.Wywoływanie stanów zapalnych. Te wyraźne etapy są regulowane przez kombinację sygnałów molekularnych, w tym chemioatraktantów. Chemoatraktant aktywuje leukocyty za pomocą ZP Cs i odgrywa kluczową rolę w kaskadzie migracyjnej.Dodatkowe badania końcowe i eksperymenty in vitro nie dostarczyły wglądu w to, jak sygnalizacja receptorów chemoatraktantów i chemoatraktantów dynamicznie regulują zachowania migracyjne leukocytów in vivo. Najnowsze postępy w technologii obrazowania dostarczyły bezprecedensowego wglądu w migrację komórek odpornościowych u żywych zwierząt, co znacznie pogłębia nasze zrozumienie molekularnej regulacji handlu komórkami immunologicznymi in vivo. Ostatnio złożyliśmy wniosek o zbadanie molekularnego mechanizmu kontrolującego transport neutrofili do miejsc zapalenia stawów.Nasze obrazowanie stawów in vivo to nowy paradygmat reakcji nadwrażliwości typu III w stanie stawu. Składnik komplementowy C5a działa jako inicjator stanu zapalnego, podczas gdy komórki tkankowe odgrywają ważniejszą rolę w stanie zapalnym w obecnym paradygmatze reakcji nadwrażliwości typu III. Dlatego obrazowanie stawu in vivo jest cenną techniką do odkrywania migrującego zachowania leukocytów i dynamiki molekularnej z zapalonym stawem.Dlatego udostępniamy ten protokół obrazowania stawów in vivo, aby wspierać grupy badawcze badające ten proces w stanach zapalnych. Przygotuj kolagen typu II z rozcieńczenia bydła w stężeniu 0,05 kwas molowy, wstrząsając przez noc w temperaturze czterech stopni, aby uzyskać rozcieńczenie mieszanki emulsji z pełnym adiuwantem Freunda w stosunku 1:2 w szklanej strzykawce. Można było też mieszanie ręcznie przez około 20 minut.Proces ten generuje ciepło, więc schładz szklaną strzykawkę zawierającą emulsję na lodzie. Mysz znieczulona przed szczepieniami. Kształtuj włosy wzdłuż ogona za pomocą maszynki do przygotowań do szczepień.Powoli wstrzykuj 100 mikrolitrów objętości emulsji do przestrzeni podskórnej blisko podstawy ogona. Kliniczne oceny artretyzmu oraz pomiar grubości łapy są niezbędne do oceny aktywności choroby. Zazwyczaj kliniczne oceny i pomiary grubości łap w przypadku artretyzmu wykonuje się co jeden do trzech dni po pierwszych szczepieniach.Kliniczny wynik artretyzmu do tego wyniku to suma wyników dla wszystkich czterech łap każdej myszy. Wyniki są rejestrowane następująco. Więc zero to nienormalność.Jednym z nich jest rumień i obrzęk jednego palca. Drugim jest rumień oraz obrzęk dwóch palców lub rumień oraz obrzęk stawu skokowego. Po trzecie: rumień i obrzęk więcej niż trzech palców lub obrzęk dwóch palców i stawu skokowego.Czwartym jest rumień i poważne obrzęk kostki, stopy i palca z deformacją. Pomiar grubości łapy jest mierzony grubością każdej łapy za pomocą cyfrowych zacisków przesuwanych. Średnia grubość łapy na wszystkich czterech łapach jest stosowana dla każdej myszy.Myszy są znieczulone, a następnie kształtują nogę myszy za pomocą maszynek. Użyj kremu do usuwania włosów, aby usunąć pozostałe włosy. Usuń krem wilgotną gazą.Stosuj sterylny lubrykant rogówki na oba oczy, aby zapobiec wysuszaniu rogówki i zmniejszyć ryzyko drgań rogówki. Pod mikroskopem chirurgicznym wykonaj nacięcie w jednym centymetrze wzdłuż skóry za pomocą mikronożyczek. Pokryj obrazowanie wcześniej, z 1,5% agarozy w PBS.Scena jest ustawiona na mikroskopie. Dostosuj ustawienia mikroskopu konfokalnego, w tym moc lasera, wzmocnienie, przesunięcie i lokalizację. Gdy odpowiednie miejsce zostanie zidentyfikowane, rozpocznij akwizycję obrazu.Reprezentatywny wynik CIA. Zazwyczaj początek artretyzmu obserwuje się około 28. dnia, a wynik kliniczny artretyzmu i grubość łapy osiągają szczyt w 35. dniu. Częstość występowania CIA u myszy DBA jednodniowych zwykle przekracza 900 do 100% do 35. dnia.Tutaj film po lewej pokazuje myszy z klubem kontrolującym miejsce, a ten po prawej pokazuje staw w myszach CIA. W tych filmach zielone komórki reprezentują neutrofile dodatnie Ly6G. Pomarańczowe komórki wskazują na dodatkowe limfocyty T na poziomie CD4, a białe obszary odpowiadają naczyniom krwionośnym.W 35. dniu wyraźnie widać, że poza naczyniami krwionośnymi występuje więcej neutrofilów Ly6G w porównaniu do CD4+T-komórek. Te neutrofile są bardzo ruchome, aktywnie poruszają się w wielu kierunkach wewnątrz zapalonego stawu. Tutaj przedstawiam reprezentatywną analizę obrazowania stawów in vivo.Wykres po lewej pokazuje liczbę nowo przyklejonych neutrofilów, natomiast ten po prawej pokazuje liczbę nowo transmigrowanych neutrofilów podczas 30-minutowego nagrania. W stawach artretycznych liczba zarówno nowo przyklejonych, jak i przetransmigrowanych neutrofilów jest znacząco wyższa niż w stawach kontrolnych. Podsumowując, przedstawiamy nasz obecny protokół obrazowania stawów in vivo, który umożliwia wysokorozdzielczą, w czasie rzeczywistym wizualizację migracyjnego zachowań leukocytów u żywych myszy w warunkach fizjologicznych i patologicznych.Ta technika pozwala nam bezpośrednio obserwować, jak komórki odpornościowe oddziałują w tkankach zapalnych, jak przylegają do ścian naczyń krwionośnych, transmigrują do tkanki oraz organizują reakcję zapalną. Dzięki temu podejściu możemy uchwycić dynamiczne zachowania komórkowe, które w innym przypadku byłyby niewidoczne konwencjonalnymi metodami histologicznymi lub in vitro. Łącząc ten system obrazowania z analizą ilościową i markerami molekularnymi, możemy odkryć kluczowe szlaki napędzające inicjację i postęp artretyzmu.Co ważne, spostrzeżenia uzyskane z tych obserwacji in vivo nie tylko pogłębiają nasze zrozumienie dynamiki komórek odpornościowych, ale także stanowią naukowe podstawy lub identyfikację nowych celów terapeutycznych. W miarę jak ta technologia będzie się rozwijać i coraz więcej badaczy dostosowuje i udoskonala metodologię, wierzymy, że obrazowanie in vivo stanie się nieodłączną platformą do badania złożonych chorób immunologicznych oraz potężnym przełamaniem łączącym podstawową immunologię z badaniami translacyjnymi i klinicznymi. Ostatecznie mamy nadzieję, że to podejście przyczyni się do rozwoju innowacyjnych terapii reumatoidalnego zapalenia stawów i innych przewlekłych chorób zapalnych w najbliższej przyszłości.

in-vivo-imaging-uncovers-migratory-behavior-leukocytes-within

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

W niniejszej pracy opisujemy nieinwazyjną metodę mikroskopii dwufotonowej (2P) służącą do badania homingu leukocytów w poduszce stopy myszy. Omówiamy aspekty techniczne przygotowania tkanki do obrazowania i przeprowadzamy czytelnika przez typowy eksperyment – od początkowej konfiguracji, przez wykonanie, aż po gromadzenie danych.

Nieinwazyjne obrazowanie homingu i migracji leukocytów in vivo

Opisujemy protokół mikroskopii intravitalnej w świetle jasnym do pomiaru dynamicznych oddziaływań między neutrofilami a komórkami śródbłonka podczas rekrutacji neutrofili w odpowiedzi na źródło chemoatraktanta dla neutrofili in vivo. Pełzanie neutrofili wewnątrz naczyniowych, migracja transendotelialna oraz chemotaksja w tkance mięśnia kroczo ścięgnistego myszy są wizualizowane za pomocą fotografii wideo z odstępami czasu i śledzone przy użyciu programu ImageJ.

Śledzenie pełzania wewnątrznaczyniowego, migracji transendotelialnej i chemotaksji neutrofili w tkankach za pomocą intravitalnej wideomikroskopii

Pokazujemy, jak wykonać obrazowanie MR makrofagów za pomocą ultramałego superparamagnetycznego środka kontrastowego (USPIO) w septycznym zapaleniu stawów, umożliwiając wstępną i podłużną nieinwazyjną ocenę infiltracji makrofagów in vivo oraz ocenę skuteczności terapii.

In vivo (in vivo) Obrazowanie makrofagów przy użyciu celowanego środka kontrastowego MR do podłużnej oceny septycznego zapalenia stawów

Opisujemy nieinwazyjną metodę obrazowania do rozróżniania etapów zapalnych. Ogólnoustrojowe dostarczanie luminolu ujawnia obszary ostrego stanu zapalnego zależne od aktywności MPO w neutrofilach. Natomiast wstrzyknięcie lucygeniny pozwala na wizualizację przewlekłego stanu zapalnego zależnego od aktywności Phox w makrofagach.

In vivo (in vivo) Metoda obrazowania w celu rozróżnienia ostrego i przewlekłego stanu zapalnego

Monocyty są kluczowymi regulatorami odporności wrodzonej i odgrywają kluczową rolę w odnowie obwodowego jednojądrzastego systemu fagocytarnego oraz w przypadku stanów zapalnych. W artykule opisano procedurę obrazowania w czasie rzeczywistym szpiku kostnego kalwarii myszy w celu zbadania mechanizmu mobilizacji monocytów.

Śledzenie monocytów szpiku kostnego myszy in vivo

To uproszczone zastosowanie mikroskopii przyżyciowej żył krezkowych u myszy może być używane w różnych modelach zapalenia do obserwacji interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów.

Mikroskopia przyżyciowa interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów w żyłach krezkowych u myszy

Szczegółowo opisujemy protokół monitorowania zachowania neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej przyżyciowej na znieczulonych myszach.

Obrazowanie neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej na znieczulonych myszach w czasie rzeczywistym

Protokół opisuje nowatorski model komory okiennej kości udowej dla myszy, który może być używany do śledzenia ruchu komórek w szpiku kości udowej in vivo. Przyżyteczna mikroskopia fluorescencyjna wielofotonowa służy do obrazowania trzech składników szpiku kostnego kości udowej (układu naczyniowego, macierzy kolagenowej i neutrofili) w czasie.

Model komory okienka kości udowej do śledzenia komórek in vivo w mysim szpiku kostnym

Ten artykuł wyjaśnia zastosowanie obrazowania fluorescencyjnego za pomocą aktywowanej sondy do obrazowania optycznego do wizualizacji in vivo aktywności kluczowych metaloproteinaz macierzy w dwóch różnych eksperymentalnych modelach zapalenia.

Nieinwazyjne obrazowanie optyczne fluorescencji in vivo zapalnej aktywności MMP przy użyciu aktywowalnego środka do obrazowania fluorescencyjnego

Tutaj pokazujemy, jak wykonać mikroskopię przyżyciową na żyłkach powłosilarnych mięśnia cremaster myszy. Powszechnie stosowany do różnych modeli zapalenia i sepsy, szczególnie tych indukowanych przez chemokiny i cytokiny, podkreślamy jego znaczenie w badaniu muskolopatii obejmujących przesadny naciek leukocytów mięśniowych.

Naciek leukocytów mięśnia Cremaster u myszy oceniany za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Migracja neutrofili polega na szybkiej i ciągłej przebudowie błony plazmatycznej w odpowiedzi na chemoatraktant i jego interakcje z mikrośrodowiskiem zewnątrzkomórkowym. Opisana w niniejszym dokumencie jest procedura oparta na przyżyciowej mikroskopii subkomórkowej w celu zbadania dynamiki przebudowy błony w neutrofilach wstrzykniętych do ucha znieczulonych myszy.

Obrazowanie migracji neutrofili w skórze myszy w celu zbadania przebudowy błony subkomórkowej w warunkach fizjologicznych

Poznaj technikę obrazowania in vivo stawów myszy w modelu CIA, aby badać migrację leukocytów i dynamikę molekularną w zapaleniu. Metoda umożliwia wizualizację komórek immunologicznych w czasie rzeczywistym.

In Vivo Obrazowanie ujawnia migracyjne zachowanie leukocytów w stawach

Przeglądaj więcej filmów