Name: Protokół oparty na fluorescencji do wstępnego badania inhibitorów syntezy białek pochodzących z naturalnych źródeł (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Poznaj fluorescencyjną metodę przesiewową inhibitorów syntezy białek z naturalnych źródeł. Protokół ten wspiera odkrywanie leków i badania chemii medycznej poprzez identyfikację nowych związków aktywnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te były wspierane przez grant NIGMS numer R15GM148983, Zarząd Regentów Luizjany LEQSF(2021-25)-RD-A-05 oraz częściowo przez U.S. National Science Foundation w ramach grantu OIA-1946231 dla F.R.

1. Przygotowanie odczynników z zestawu
UWAGA: Odpowiednio wymieszać, odkręcać i trzymać wszystkie odczynniki na lodzie do czasu użycia.
<ol>
	<li>Zorganizować i pozyskać zestaw hamujący syntezę białek, bufor PBS, pożywkę do hodowli komórkowej, płytki obtraktowane hodowlą, stożkowe rurki do wirówki polipropylenowej o pojemności 15 mL, rurki wirówki o pojemności 2 mL, pipety p10, p20, p200 i p1000 oraz odpowiednie końcówki.</li>
	<li>Przygotuj bufor do mycia.<ol>
		<li>Rozmroź bufor 10x w temperaturze 37 °C, obejmując fiolkę w dłoni. Używaj ciepła ciała w dłoniach do rozmrażania i często sprawdzaj, czy rozmrażanie jest zakończone.</li>
		<li>Rozcieńcz 10x zapasy bufora płukania w stosunku 1:10 w wodzie zdejonizowanej w rurce wirówki. Mieszaj przez inwersję lub ponowną suspensję przez pipetowanie w górę i w dół. Przechowywać w lodzie do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozmraź roztwór utrwalający w temperaturze pokojowej. Przechowywać w lodzie do czasu użycia.</li>
	<li>Przygotuj bufor permeabilizacyjny.<ol>
		<li>Rozmroź 10-krotny bufor permeabilizacyjny w temperaturze 37 °C, chwytając fiolkę w dłoni. Używaj ciepła ciała w dłoniach do rozmrażania i często sprawdzaj, czy rozmrażanie jest zakończone.</li>
		<li>Rozcieńcz 10x zapas 1:10 w wodzie dejonizowanej w rurce wirówki. Mieszaj składniki przez odwrócenie lub ponowne zawieszenie pipetowaniem w górę i w dół. Przechowywać w lodzie do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozmrozić 400x białkowy znak, 100x fluorescencyjny azyd, 100x cykloheksymid, barwnik DNA i 20x reduktor w temperaturze pokojowej. Trzymaj na lodzie w ciemnym środowisku podczas użytkowania. Przykryj barwniki folią lub przechowuj je w lodówce o temperaturze 2°C, gdy nie są używane.</li>
</ol>
2. Kontrola znakowania i komórki eksperymentalne
UWAGA: Protokół ten został opracowany przy użyciu stabilnych, przylegających komórek nabłonkowego raka piersi MDA-MB-231. Można użyć dowolnych linii komórek przylegających. Wszystkie poniżej wymienione kroki wykorzystują płytę z 96 dołkami, a wszystkie objętości i stężenia są obliczane dla dwóch związków testowych i dwóch kontrolnych o objętości roboczej 100 μL.
<ol>
	<li>Hodowanie komórek ssaków przylegających UWAGA: Komórki powinny być przepuszczane przed osiągnięciem 80-90% konfluencji, aby utrzymać zdrowy, wykładniczy wzrost i zapobiec hamowaniu lub różnicowaniu kontaktu.</li>
	<li>Rozmroź fiolkę z komórkami krioprezerwacji do temperatury pokojowej, a następnie rozcieńcz odpowiednim medium.</li>
	<li>Wiruj zawiesinę, aby rozpylić komórki i zasysać supernatant. Ponownie zawiesić pellet w świeżym medium i przenieść go do nowej kolby o odpowiedniej gęstości komórek.</li>
	<li>Gdy komórki są w 80% zbiegnięte, usuń podłoże i aspiruj medium starego wzrostu z kolby. Następnie płucz komórki sterylnym PBS, aby usunąć surowicę resztkową, która hamuje trypsynę. Dodaj roztwór trypsyny-EDTA, aby pokryć warstwę komórkową i inkubuj przez 3-5 minut lub do momentu odłączenia się komórek w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodaj kompletne medium zawierające surowicę, aby inaktywować trypsinę, następnie przenieś zawiesinę komórkową do probówki, delikatnie wymieszaj i policz komórki.</li>
	<li>Komórki nasienne na płytkach przesiewowych rozcieńczają komórki w odpowiednim stosunku podziału (np. 1:3 lub 1:5) do świeżych kolb z nowym medium i inkubują (zazwyczaj 37 °C, 5%CO2), aby uzyskać pożądane stężenie komórek. UWAGA: W przypadku opisanego tutaj eksperymentu linia komórkowa została pokryta w temperaturze 2 × 10°4 na dołek (płytka 96-dołkowa) i inkubowana w temperaturze 37 °C przez 12 godzin.</li>
</ol>
3. Dodawanie związków
<ol>
	<li>Przygotuj mieszankę główną A.<ol>
		<li>Oznacz rurkę wirówki jako "A". Pipeta 598,5 μL podłoża hodowlanego i 1,5 μL białka do "A". Ponownie zawiesij mieszankę, aby zapewnić jednorodność, pipetując w górę i w dół.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj mieszankę master B.<ol>
		<li>Oznacz rurkę wirówki jako "B". Pipeta 1,5 μL białkowego znaku, 6,6 μL cykloheksymidu oraz 591,9 μL medium hodowlanego do "B". Ponownie zawiesij mieszankę, aby zapewnić jednorodność, pipetując w górę i w dół.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lecz komórki pożądanymi związkami (Rysunek 1), kontrolą dodatnimi i negatywnymi.<ol>
		<li>Usuń komórki z inkubatora i usuń podłoże za pomocą aspiracji. Przechyl płytkę i zasysaj z boku dołka zamiast w środku, aby zapobiec zakłóceniom komórek.</li>
		<li>Pipeta włóż 1 μL substancji testowej do odwiertu i 1 μL pojazdu testowego (0,1% v/v DMSO) do odwiertu. W przypadku badań podwójnych dodaj każdą próbkę do drugiego dołka i powtórz ten proces. Do tych otworów dodaj 99 μL mieszanki głównej A. Delikatnie pipetuj pod kątem w stronę boku, aby zapobiec zakłóceniom kinetycznym komórek. UWAGA: Maksymalne stężenie DMSO w badaniach przesiewowych złożonych zależy od typu komórki i testu, ale ogólne wytyczne to: 0,1-0,5% DMSO – ogólnie bezpieczne dla większości testów komórkowych o minimalnej toksyczności oraz 1% – DMSO – maksymalnie i akceptowalne dla wielu typów komórek w testach krótkoterminowych.</li>
		<li>Pipeta 100 μL mieszanki B do dwóch wgłębień. Pipetę podkładaj pod kątem do boku dołka, aby zapobiec zakłóceniu komórek.</li>
		<li>Delikatnie stuknij w płytę, aby uzyskać włączenie pożądanych składników do komórek. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez 0,5-2 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Zakończenie eksperymentu i płukanie komórek
<ol>
	<li>Usuń podłoże przez aspirację. Przechyl płytkę i zasysaj z boku dołka zamiast w środku, aby zapobiec zakłóceniom komórek.</li>
	<li>Dodaj 100 μL buforu PBS do każdego dołka i wiruj płytę w 900 × g przez 5 minut.</li>
	<li>Usuń bufor PBS przez aspirację.</li>
</ol>
5. Fiksacja i permeabilizacja
<ol>
	<li>Dodaj 100 μL roztworu utrwalającego do każdej dołki. Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez 15 minut w ciemnym środowisku.</li>
	<li>Usuń roztwór utrwalający przez aspirację. Przechyl płytę i zasysaj z boku studni zamiast na środku.</li>
	<li>Płucz komórki 100 μL buforu i usuwaj bufor przez aspirację. Powtórz ten krok dwa razy.</li>
	<li>Dodaj 100 μL buforu permeabilizacyjnego do każdego dołku i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Usuń bufor permeabilizacyjny przez aspirację. Przechyl płytę i zasysaj z boku studni zamiast na środku.</li>
</ol>
6. Reakcja białkowa i barwienie
<ol>
	<li>Przygotuj mieszankę koktajli reakcyjnych.<ol>
		<li>Dodaj 651 μL buforu PBS, 7,0 μL 100x miedziowego odczynnika, 7 μL azydu fluorescencyjnego oraz na koniec 35 μL środka redukującego do rurki wirówki. Ponownie zawiesij tę mieszankę, aby zapewnić jednorodność. UWAGA: Stosuj się dokładnie do tej kolejności przy dodawaniu odczynników. Użyj w ciągu 15 minut od przygotowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj 100 μL koktajlu reakcji do każdego dołku. Inkubuj komórki przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemnym środowisku, aby zapobiec fotobieleniu.</li>
	<li>Ogniwa wirówkowe na 900 × g przez 5 minut. Zrównoważ wirówkę, dodając puste talerze, aby równomiernie rozłożyć ciężar. Usuń mieszankę przez aspirację.</li>
	<li>Płucz komórki 100 μL buforu i usuwaj bufor przez aspirację. Powtórz ten krok dwa razy.</li>
</ol>
7. Barwienie DNA
<ol>
	<li>Przygotuj 1-krotne rozcieńczenie całkowitego barwienia DNA i dodaj 100 μL do każdego dołku. Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez 20 minut w ciemnym środowisku, aby zapobiec fotobieleniu.</li>
	<li>Wiruj płytę w 900 × g przez 5 minut. Zrównoważ wirówkę, dodając puste talerze, aby równomiernie rozłożyć ciężar. Usuń mieszankę przez aspirację.</li>
	<li>Płucz komórki 100 μL buforu i usuwaj bufor przez aspirację. Powtórz ten krok dwa razy.</li>
	<li>Ponownie zawiesz komórki 100 μL schłodzonego buforu PBS, aby przygotować je do obrazowania.</li>
</ol>
8. Obrazowanie
<ol>
	<li>Włóż płytkę do czytnika tablic.</li>
	<li>Ustaw powiększenie na 20x.</li>
	<li>Przeanalizuj barwienie jądra za pomocą kanału GFP 469/525 nm. Używaj automatycznego binowania i autofocusa, aby poprawić wyniki obrazowania.</li>
	<li>Przeanalizuj aktywną syntezę białek za pomocą kanału Texas Red 586/647nm. Używaj automatycznego binowania i autofocusa, aby poprawić wyniki obrazowania.</li>
</ol>

<ol><li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+regulation+of+eukaryotic+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Mechanism and regulation of eukaryotic protein synthesis.</a> Microbiol Rev. 56, 291-315 (1992).</li>
<li>Ng, L., Navarro, A., Law, W. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editorial%3A+evolving+roles+of+piRNAs+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Editorial: evolving roles of piRNAs in solid tumors.</a> Front Oncol. 13, 1178634(2023).</li>
<li>Brown, J. M., Giaccia, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unique+physiology+of+solid+tumors%3A+opportunities+%28and+problems%29+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy.</a> Cancer Res. 58 (7), 1408-1416 (1998).</li>
<li>Kovalski, J. R., Kuzuoglu-Ozturk, D., Ruggero, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+control+in+cancer%3A+selectivity+and+therapeutic+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis control in cancer: selectivity and therapeutic targeting.</a> EMBO J. 41 (8), e109823(2022).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+silvestrol+analogues+as+potent+and+selective+protein+synthesis+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthetic silvestrol analogues as potent and selective protein synthesis inhibitors.</a> J Med Chem. 55 (20), 8859-8878 (2012).</li>
<li>Liu, L., Li, Z., Wu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+natural+inhibitors+of+protein+synthesis+for+cancer+therapy%3A+a+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">Harnessing natural inhibitors of protein synthesis for cancer therapy: a comprehensive review.</a> Pharmacol Res. 209, 107449(2024).</li>
<li>Dias, D. A., Urban, S., Roessner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+historical+overview+of+natural+products+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">A historical overview of natural products in drug discovery.</a> Metabolites. 2 (2), 303-336 (2012).</li>
<li>Broach, J. R., Thorner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening for drug discovery.</a> Nature. 384 (6604 Suppl), 14-16 (1996).</li>
<li>Fang, X., Zheng, Y., Duan, Y., Liu, Y., Zhong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+design+of+fluorescence-based+assays+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Recent advances in design of fluorescence-based assays for high-throughput screening.</a> Anal Chem. 91 (1), 482-504 (2019).</li>
<li>McKay, C. S., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+chemistry+in+complex+mixtures%3A+bioorthogonal+bioconjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Click chemistry in complex mixtures: bioorthogonal bioconjugation.</a> Chem Biol. 21 (9), 1075-1101 (2014).</li>
<li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nat Chem Biol. 6 (3), 209-217 (2010).</li>
<li>Liu, J., Xu, Y., Stoleru, D., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein+synthesis+in+cells+and+tissues+with+an+alkyne+analog+of+puromycin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Imaging protein synthesis in cells and tissues with an alkyne analog of puromycin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (2), 413-418 (2012).</li>
<li>Liu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+cell+lines+as+models+for+metastatic+breast+cancer+through+integrative+analysis+of+genomic+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Evaluating cell lines as models for metastatic breast cancer through integrative analysis of genomic data.</a> Nat Commun. 10, 2138(2019).</li>
<li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dehydroabietylamine+exerts+antitumor+effects+by+affecting+nucleotide+metabolism+in+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Dehydroabietylamine exerts antitumor effects by affecting nucleotide metabolism in gastric cancer.</a> Carcinogenesis. 45 (10), 759-772 (2024).</li>
<li>Shinde, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+single-cell+adhesion+force+kinetics+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">A review of single-cell adhesion force kinetics and applications.</a> Cells. 10 (3), 577(2021).</li>
<li>Vargas-Accarino, E., Herrera-Montávez, C., Ramón y Cajal, s, Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+cell+detachment+and+reattachment+in+cancer+cell+lines%3A+an+in+vitro+model+of+metastasis+and+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Spontaneous cell detachment and reattachment in cancer cell lines: an in vitro model of metastasis and malignancy.</a> Int J Mol Sci. 22 (9), 4929(2021).</li>
<li>Song, L., Hennink, E. J., Young, I. T., Tanke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photobleaching+kinetics+of+fluorescein+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Photobleaching kinetics of fluorescein in quantitative fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 68 (6), 2588-2600 (1995).</li>
<li>Ling, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dehydroabietylamine+derivatives+target+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Dehydroabietylamine derivatives target triple-negative breast cancer.</a> Eur J Med Chem. 102, 9-13 (2015).</li>
<li>Gautam, L. N., Ling, T., Lang, W., Rivas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-proliferative+evaluation+of+monoterpene+derivatives+against+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Anti-proliferative evaluation of monoterpene derivatives against leukemia.</a> Eur J Med Chem. 113, 75-80 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Protokół ten zapewnia fluorometryczną metodologię przesiewania do testowania produktów naturalnych i małych cząsteczek w celu oceny ich zdolności do hamowania syntezy białek. Prostota tego protokołu pozwala studentom naukowcom na poprawne wdrożenie go, co pozwala im wnosić istotny wkład w wiedzę naukową. Protokół wymaga podstawowego zrozumienia metod i technik biologicznych, a kroki wymagają starannego wykonywania, aby zapewnić dokładne i wiarygodne wyniki.
Na przykład krok protokołu 2.1 wymag...

Synteza białek obejmuje ściśle regulowane procesy: transkrypcję i translację. Podczas transkrypcji kopiowane są sekwencje DNA genów, tworząc mRNA posłańca (mRNA). Enzym polimeraza RNA pracuje w celu rozdzielenia podwójnej helisy DNA i wykorzystuje jedną nić jako przewodnik do budowy dopasowanej cząsteczki mRNA. Gdy mRNA jest w pełni uformowane, przemieszcza się z jądra do cytoplazmy w celu translacji. Translacja zachodzi w rybosomie, gdzie mRNA służy jako szablon do składania aminokwasów w łańcuch polipeptydowych. Ten łańcuch polipeptydowy po opuszczeniu tunelu wyjściowego rybosomu zostaje złożony w białko funkcjonalne. Transkrypcja jest regulowana głównie przez czynniki transkrypcyjne, modyfikacje chromatyny oraz regulacyjne RNA, natomiast translacja jest regulowana przez czynniki inicjacyjne, szlaki sygnalizacyjne i mechanizmy stabilności RNA. Te systemy regulacyjne pozwalają komórkom skutecznie utrzymywać funkcje komórkowe i reagować na stres lub uszkodzenia1.
Zdecydowana większość nowotworów u ludzi — około 85% — objawia się jako guzy lite2. Chociaż guzy te mogą się znacznie różnić pod względem cech i zachowań, mają tendencję do wspólnych cech fizjologicznych i wzorców, takich jak zwiększona synteza białek, niezależnie od etiologii czy pozycji anatomicznej3. Komórki nowotworowe dysregulują syntezę białek, przejmując mechanizmy translacyjne, aby wspierać wysokie zapotrzebowanie energetyczne i niekontrolowany wzrost. To przeprogramowanie jest wynikiem dysregulacji niemal wszystkich głównych onkogennych szlaków sygnalizacyjnych, co sprzyja przetrwaniu komórek, ich proliferacji i przerzutom, jednocześnie hamując szlaki śmierci komórkowej4. W komórkach nowotworowych mechanizmy tworzenia rybosomów wchodzą w nadzwyciężoną ekspresję, umożliwiając zwiększaną produkcję białek i szybki podział komórek. Ponieważ ta zwiększona synteza białek jest kluczowa dla przeżycia w raku, leczenie ukierunkowane i blokujące ten proces wykazują obiecujące możliwości jako potencjalne terapie5. Dlatego badania koncentrujące się na specyficznych dla raka czynnikach translacyjnych, unikalnym składzie rybosomalnym lub zmienionych szlakach sygnalizacyjnych regulujących syntezę białek mogłyby przynieść bardziej ukierunkowane inhibitory z lepszymi oknami terapeutycznymi.
Ponieważ produkty naturalne (NP) są znane ze swojej szerokiej aktywności biologicznej, opracowanie selektywnych inhibitorów syntezy białek do leczenia nowotworów z wykorzystaniem ich rusztowania jest obiecującym podejściem 6,7. NP mogą celować w różne składniki mechanizmu syntezy białek, od wiązania rybosomów po zakłócenia czynników inicjacyjnych czy procesy wydłużania, co czyni je nieocenionymi punktami wyjścia w rozwoju leków do inhibitorów syntezy białek w guzach litych6. Możliwość szybkiego przesiewania związków pod kątem pożądanej aktywności stanowi kluczowy punkt wejścia dla platform odkrywania leków, które chcą efektywnie identyfikować trafienia NP. Zazwyczaj wysokoprzepustowe badania przesiewowe związków wykorzystują testy fluorescencji, aby szybko zawęzić wybór cząsteczek kandydatów na ołów8.
Naukowcy na całym świecie polegają na technikach opartych na fluorescencji jako kluczowych narzędziach do analizy systemów biologicznych. Te podejścia są szeroko stosowane do badania procesów komórkowych, umożliwiając badaczom śledzenie interakcji biomolekularnychw czasie rzeczywistym. W połączeniu z bioortogonalnymi reakcjami klikowej chemii metody te umożliwiają precyzyjną wizualizację syntezy białek10. Prezentowany test syntezy białek fluorescencyjnych to nieradioaktywna technika oceny syntezy białek, wykorzystująca O-propargyl-puromycynę (OPP), przepuszczalny dla komórek alkinowy analog puromycyny. Po leczeniu komórkowym OPP zostaje włączony na końcu C wydłużających się łańcuchów polipeptydowych, powodując przerwanie translacji. Te białka skrócone znakowane alkinami są następnie wykrywane za pomocą chemii klikowej katalizowanej miedzią sprzężonej z 5 FAM-azydami.
Ten test fluorometryczny jest cennym narzędziem badawczym i dostępną metodą biologii chemicznej do kształcenia studentów studiów licencjackich. Dzięki zapewnieniu dostępnego, wydajnego protokołu z minimalnym przetwarzaniem danych, zapewnia studentom praktyczne doświadczenie w nowoczesnych technikach odkrywania leków i przyspiesza proces odkrywania leków. Wraz ze wzrostem zapotrzebowania na nowe inhibitory syntezy białek, takie podejście wyposaża studentów licencjackich w znaczące możliwości badawcze, jednocześnie przyczyniając się do postępu w terapii onkologicznej.

<table><tbody><tr><td>Agilent Biotek Cytation 1 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>BTCYT1V</td><td></td></tr><tr><td>Związek 1 (Dehydroabietylamina, CAS 1446-61-3)</td><td>Enamine</td><td>EN300-7409771</td><td></td></tr><tr><td>Związek 2 (Bakuchiol, CAS 10309-37-2)</td><td>ChemFaces</td><td>CFN99047</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Megafuge 16R</td><td>Thermo Scientific &nbsp;</td><td>75004271</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi Gmbh – płyta 96-dołowa</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>Linie komórkowe MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Fosforanowa buforowana sól fizjologiczna pH 7,4</td><td>ATCC</td><td>ATCC 30-2200</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do analizy syntezy białek (zielony)</td><td>Abcam</td><td>Ab239725</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół oparty na fluorescencji do wstępnego badania inhibitorów syntezy białek pochodzących z naturalnych źródeł

A Fluorescence-based Protocol for Preliminary Screening of Protein Synthesis Inhibitors from Natural Sources

Produkty naturalne stanowią bogate źródło związków terapeutycznych z zastosowaniami w wielu chorobach, szczególnie w nowotworach. Wykorzystując te biomolekuły jako strukturalne szablony podczas odkrywania leków, naukowcy osiągnęli zarówno szybsze harmonogramy rozwoju, jak i poprawę skuteczności biologicznej w porównaniu z w pełni syntetycznymi związkami. Szlak syntezy białek stał się ważnym celem dla produktów naturalnych, zwłaszcza biorąc pod uwagę jego udział w trudnych do leczenia nowotworach. Silny inhibitor syntezy białek, cykloheksymid, pochodzący ze Streptomyces griseus, ilustruje potencjał naturalnych związków w tej dziedzinie. W miarę jak te pochodne produktów naturalnych są rozwijane w cząsteczki przypominające leki, potwierdzenie ich aktywności hamującej syntezę białek pozostaje kluczowym krokiem walidacyjnym. Głównym celem jest zapewnienie przyjaznego studentom licencjackiego protokołu umożliwiającego szybką ocenę aktywności hamowania związków związkowych. Protokół wykorzystuje fluorescencyjne podłoże oraz zaawansowane techniki mikroskopii fluorescencyjnej do systematycznego wykrywania i mierzenia właściwości hamujących tych naturalnych produktów. Badanie obejmowało związki pochodzące z dwóch gatunków roślin: Pinus sylvestris i Psoralea corylifolia. Stosując cykloheksimid jako inhibitor referencyjny, oba produkty naturalne wykazywały różne poziomy hamowania syntezy białek.

Test ten wykorzystał fluorescencję do wizualizacji i ilościowej zdolności różnych naturalnych produktów do hamowania syntezy białek. Cykloheksimid (CHX) to znany inhibitor syntezy białek, którego sposób działania polega na zakłócaniu procesu translokacji podczas wydłużania11. W tym badaniu wykryto żywe komórki za pomocą zielonego, fluorescencyjnego barwnika jądrowego. OPP to pochodna puromycyny, która kowalencyjnie wiąże się z młodymi białkami12. Linia komórkowa MDA-MB-231 ...

Protokół ten wprowadza fluorometryczną metodologię przesiewania zoptymalizowaną do identyfikacji produktów naturalnych/inhibitorów małych cząsteczek syntezy białek. Jego praktyczność sprawia, że nadaje się zarówno do nauczania technik odkrywania leków na poziomie licencjackim, jak i do wdrażania w kampaniach chemii medycznej.

Protokół oparty na fluorescencji do wstępnego badania inhibitorów syntezy białek pochodzących z naturalnych źródeł

Natural products represent a rich source of therapeutic compounds with applications across multiple diseases, particularly cancer. By leveraging these ...

Protokół oparty na fluorescencji do wstępnego badania inhibitorów syntezy białek pochodzących z naturalnych źródeł. Synteza białek obejmuje silnie regulowane procesy, transkrypcję i translację. Transkrypcja jest regulowana głównie przez czynniki transkrypcyjne, modyfikacje chromatyny oraz RNA regulacyjne.Translacja jest regulowana przez czynniki inicjacyjne, szlaki sygnalizacyjne i mechanizmy stabilności RNA. Te systemy regulacyjne pozwalają komórkom utrzymywać funkcje komórkowe i skutecznie reagować na stres lub uszkodzenia. Komórki nowotworowe dysregulują syntezę białek, przejmując mechanizmy translacyjne, aby wspierać wysokie zapotrzebowanie energetyczne i niekontrolowany wzrost.To przeprogramowanie jest wynikiem dysregulacji niemal wszystkich głównych onkogennych szlaków sygnalizacyjnych, co sprzyja przetrwaniu, proliferacji i przerzutom komórek, jednocześnie hamując szlaki śmierci komórkowej. Ponieważ ta zwiększona synteza białek jest kluczowa dla przeżycia w raku, leczenie ukierunkowane i blokujące ten proces wykazują obiecujące możliwości terapii. Aby zidentyfikować inhibitory syntezy białek, można zastosować następujący test hamowania syntezy białek – fluorescencję.Przed rozpoczęciem eksperymentu, aby uzyskać wiarygodne wyniki, związki muszą być podawane w odpowiednim stężeniu poniżej progu toksyczności. Aby ustalić stężenie początkowe, należy przeprowadzić test cytotoksyczności w celu określenia EC 50 w związku. Jeśli nie jest to możliwe, związki zawarte w tym testie można przebadać w sposób zależny od dawki, aby określić najbardziej efektywne parametry stężenia.Jeśli stężenie związków powoduje śmierć komórki, konieczne staje się badanie w niższych stężeniach. Ważne jest również, aby chronić barwniki przed światłem przez cały czas, gdy nie są używane. Dłuższa ekspozycja na światło prowadzi do fotobielenia, co prowadzi do pogorszenia jakości danych.Krok 3.1: przygotować mieszankę główną A, oznaczyć rurkę wirówki jako A, następnie pipetować 598,5 mikrolitra podłoża hodowlanego i 1,5 mikrolitra białka do A. Ponownie zawiesić tę mieszaninę, aby zapewnić jednorodność poprzez pipetowanie w górę i w dół. Teraz przygotuj mieszankę główną B. Oznacz rurkę wirówki jako B, następnie pipetuj 1,5 mikrolitra białkowego znaku, 6,6 mikrolitra cykloheksimidu i 591,9 mikrolitra pośrodka hodowlanego do B. Ponownie zawiesij tę mieszaninę, aby zapewnić jednorodność poprzez pipetowanie w górę i w dół. Po pipetowaniu jednego mikrolitra substancji testowej i jednego mikrolitra nośnika do dwóch dołków, delikatnie pipetuję 99 mikrolitrów mieszanki głównej A do obu tych dołków, pipetuję pod kątem w stronę boku, aby zapobiec zakłóceniu kinetycznym komórek.Podaj pipetą 100 mikrolitrów mieszanki B do dwóch nieoczyszczonych dołków. Pipetę podkładaj pod kątem w bok dołka, aby zapobiec zakłóceniom kinetycznym komórek. Delikatnie stuknij w płytę, aby uzyskać dokładne włączenie pożądanych składników do komórek.Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut do dwóch godzin. Usuń podłoże z hodowli komórkowej poprzez aspirację. Przechyl płytkę i zasysaj z boku dołka zamiast w środku, aby zapobiec zakłóceniom kinetycznym komórek.Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu PBS do każdego dołka i wiruj płytę w 900g przez pięć minut. Po wirowaniu pamiętaj, aby usunąć bufor PBS przez aspirację. Krok piąty: fiksacja i permeabilizacja.Dodaj 100 mikrolitrów roztworu utrwalacza do każdego dołku. Następnie inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez 15 minut w ciemnym środowisku. Następnie zasysaj komórki.Przemyj komórki 100 mikrolitrami buforu i usuń przez aspirację. Powtórz to dwa razy. Do każdego dołku dodaj 100 mikrolitrów buforu permeabilizacyjnego.Następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Usuń bufor permeabilizacyjny przez aspirację. Krok szósty: reakcja białkowa i barwienie.Przygotuj mieszankę koktajli reakcyjnych. Dodaj 651 mikrolitrów buforu PBS do rurki wirówki. Następnie dodaj siedem mikrolitrów 100x odczynnika miedzi.Następnie siedem mikrolitrów azydu fluorescencyjnego. Na koniec dodaj 35 mikrolitrów środka redukującego do rurki wirówki. Stosuj się dokładnie do tej kolejności przy dodawaniu odczynników, a następnie dodaj 100 mikrolitrów koktajlu reakcji do każdego dołku.Inkubuj komórki przez 30 minut w ciemnym środowisku w temperaturze pokojowej, aby zapobiec fotobieleniu. Wiruj ogniwa w 900g przez pięć minut. Aspiruj, myj komórki, a potem ponownie aspiruj.Przygotuj 1x rozcieńczenie całkowitego barwienia DNA i dodaj 100 mikrolitrów do każdego dołku. Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez 20 minut w ciemnym środowisku, aby zapobiec fotobieleniu. Wiruj płytę w 900g przez pięć minut.Przemyj komórki 100 mikrolitrami buforu do mycia, usuwaj przez aspirację. Powtórz ten krok dwa razy. Na koniec ponownie zawiesij komórki 100 mikrolitrami schłodzonego buforu PBS, aby przygotować je do obrazowania.Krok ósmy, obrazowanie. Włóż płytkę do czytnika płyt i ustaw powiększenie na 20x. Przeanalizuj barwienie jądra za pomocą kanału GFP o średnicy 469/525 nanometrów.Stosuj automatyczne zginanie i autofokus, aby poprawić wyniki obrazowania. Przeanalizuj aktywną syntezę białek za pomocą kanału Texas Red o średnicy 586/647 nanometrów. Stosuj automatyczne zginanie i autofokus, aby poprawić wyniki obrazowania.Sondy fluorescencyjne są wrażliwe na fotobielenie, czyli zjawisko, w którym promieniowanie z naświetleniem powoduje utratę fluoroforów ich właściwości fluorescencyjnych. Barwniki powinny być zawsze chronione przed światłem, gdy nie są używane. Dodatkowo należy ograniczyć liczbę skanów w każdej studni i czasie pod napromieniowanym światłem.Długotrwała ekspozycja na światło prowadzi do fotobielenia, co ostatecznie prowadzi do pogorszenia jakości danych. Spójrzmy na reprezentatywne wyniki. Żywe komórki tutaj są widoczne na zielono, a aktywna synteza białek jest oznaczona czerwienią.Znany inhibitor syntezy białek cykloheksymid powoduje znaczny spadek syntezy białek, co widać na rysunku 1B. W porównaniu do negatywnego DMSO z rysunku 1A, emituje się mniej czerwonego światła fluorescencyjnego. Leczenie związkiem 1, jak pokazano na rysunku 1C, skutkowało albo odłączeniem komórek, albo śmiercią komórek. Dlatego nie możemy wysuwać żadnych jednoznacznych twierdzeń dotyczących aktywności hamującej syntezę białek.Wymaga to dalszych badań dawkowo-odpowiedzi, aby ustalić, czy hamuje syntezę białek przy niższych stężeniach. Związek drugi wykazuje umiarkowane hamowanie syntezy białek, jak pokazano na rysunku 1D. Ten test fluorometryczny jest cennym narzędziem badawczym i dostępną metodą biologii chemicznej do kształcenia studentów studiów licencjackich.Dzięki zapewnieniu dostępnego, wydajnego protokołu z minimalnym przetwarzaniem danych, zapewnia studentom praktyczne doświadczenie oraz nowoczesne techniki odkrywania leków oraz przyspiesza proces odkrywania leków. Protokół wykorzystuje fluorescencyjne podłoże oraz zaawansowane techniki mikroskopii fluorescencyjnej do systematycznego wykrywania i mierzenia właściwości hamujących związków naturalnych produktów jeden i dwa. Stosując cykloheksimid jako inhibitor referencyjny, oba produkty naturalne wykazywały różne poziomy hamowania syntezy białek.Wraz ze wzrostem zapotrzebowania na nowe inhibitory syntezy białek, takie podejście wyposaża studentów licencjackich w znaczące możliwości badawcze, jednocześnie przyczyniając się do postępu w terapii onkologicznej.

a-fluorescence-based-protocol-for-preliminary-screening-protein

Research

JoVE Journal

Cancer Research

W tym filmie pokazujemy test jednorodności zbliżeniowej ze wzmocnioną luminescencją - test zbliżeniowy oparty na koralikach. Wykorzystuje kulki akceptora i dawcy o jednorodnej wielkości, unieruchomione dwoma białkami, które mają tendencję do oddziaływania w celu przesiewania potencjalnych małych cząsteczek hamujących interakcje białek.

Amplifikowany luminescencyjny test jednorodny zbliżeniowy: Test zbliżeniowy oparty na kulkach do badania przesiewowego małych cząsteczek hamujących interakcje białko-białko

Ten film pokazuje badanie przesiewowe związków immunomodulujących za pomocą testu fluorescencyjnego. Transgeniczne limfocyty T pochodzące od myszy z kasetami ekspresji białek zielonej fluorescencji są traktowane tymi związkami. Wzmocnione i zredukowane sygnały GFP umożliwiają identyfikację odpowiednio stymulującego i hamującego działania związków.

Test oparty na fluorescencji z wykorzystaniem zmodyfikowanych limfocytów do badań przesiewowych związków immunomodulujących

Przedstawiono uproszczone podejście do badań przesiewowych pod kątem ekspresji rekombinowanych białek błonowych u Escherichia coli oparte na fuzji z białkiem zielonej fluorescencji.

Badania przesiewowe białek błonowych Escherichia coli oparte na białkach zielonej fluorescencji

Przedstawiono protokół badań przesiewowych leków małocząsteczkowych oparty na syntezie in-situ ultramałych fluorescencyjnych nanoklastrów złota (Au NCs) przy użyciu białka obciążonego lekiem jako matrycy. Metoda ta jest prosta do określenia powinowactwa wiązania leków z białkiem docelowym za pomocą widzialnego sygnału fluorescencyjnego emitowanego z matrycami białkowymi Au NC.

Szybka i ilościowa metoda fluorymetryczna do badań przesiewowych leków małocząsteczkowych ukierunkowanych na białka

Prezentujemy w obecnym badaniu nowatorski test oparty na fluorescencji, wykorzystujący limfocyty pochodzące od transgenicznej myszy. Test ten nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) małych cząsteczek obdarzonych zdolnością hamowania lub promowania aktywacji limfocytów.

Test limfocytów oparty na fluorescencji, odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek

Ten manuskrypt opisuje metodę wizualizacji i ilościowego określania zlokalizowanych zdarzeń translacji w subkomórkowych przedziałach. Podejście zaproponowane w tym manuskrypcie wymaga podstawowego systemu obrazowania konfokalnego i odczynników oraz jest szybkie i opłacalne.

Immunofluorescencja ilościowa do pomiaru globalnej translacji zlokalizowanej

Łatwa i elastyczna metoda mikrorozcieńczania bulionu do badania związków przeciwgrzybiczych i ekstraktów.

Mikrorozcieńczenie bulionu Badania przesiewowe in vitro: łatwa i szybka metoda wykrywania nowych związków przeciwgrzybiczych

Tutaj prezentujemy szczegółową procedurę niedawno opracowanej platformy do testowania proteazy, wykorzystującej N-końcowe białko wiążące heksahistydynę/maltozę oraz rekombinowane substraty z fluorescencyjną fuzją białek przyczepione do powierzchni magnetycznych kulek agarozy kwasu niklowo-nitrylotrioctowego. Przedstawiono również późniejszą analizę w żelu próbek testowych oddzielonych elektroforezą w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakryloamidu.

Zastosowanie rekombinowanych białek fuzyjnych w fluorescencyjnej platformie testowej proteazy i ich renaturacja w żelu

Śledzenie indywidualnych zdarzeń translacji pozwala na badania kinetyczne w wysokiej rozdzielczości mechanizmów translacji zależnych od czapek. Tutaj demonstrujemy test pojedynczej cząsteczki in vitro oparty na obrazowaniu interakcji między fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami a powstającymi peptydami znakowanymi epitopami. Metoda ta umożliwia jednocząsteczkową charakterystykę kinetyki inicjacji i wydłużania peptydów podczas aktywnej translacji in vitro zależnej od kapu.

Test obrazowania pojedynczych cząsteczek in vitro do analizy kinetyki translacji zależnej od czapeczki

Monitorowanie zmian temperatury topnienia docelowego białka (np. test przesunięcia termicznego, TSA) jest efektywną metodą badania bibliotek fragmentów kilkuset związków. Przedstawiamy protokół TSA implementujący wspomaganą robotyką nanoróżnicową fluorymetrię skaningową (nano-DSF) do monitorowania wewnętrznej fluorescencji tryptofanu i rozpraszania wstecznego światła w celu badania przesiewowego fragmentów.

Nanoróżnicowa fluorymetria skaningowa do badań przesiewowych w wykrywaniu odprowadzeń na podstawie fragmentów

Protokół ten opisuje test biochemiczny przesunięcia żelu do pomiaru aktywności FEN1 (endonukleazy płatowej 1) i rozwoju inhibitora.

Fluorescencyjne wykrywanie aktywności nukleazy FEN1 i badania przesiewowe inhibitorów drobnocząsteczkowych

Poznaj fluorescencyjną metodę przesiewową inhibitorów syntezy białek z naturalnych źródeł. Protokół ten wspiera odkrywanie leków i badania chemii medycznej poprzez identyfikację nowych związków aktywnych.

Protokół oparty na fluorescencji do wstępnego badania inhibitorów syntezy białek pochodzących z naturalnych źródeł

Przeglądaj więcej filmów