Name: Szybka optymalizacja systemu indukowalnego światłem do kontroli ekspresji genów ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-04T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Poznaj metodę optymalizacji ekspresji genów indukowanej światłem w komórkach HEK293T przy użyciu narzędzia optogenetycznego LACE i drukowanej w 3D matrycy LED.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te są wspierane przez Instytut Badań Translacyjnych poprzez NASA Cooperative Agreement NNX16AO69A oraz przez Good Foods Institute. Projekt ten był wspierany przez Laboratorium Współdzielonych Zasobów Przepływowej Cytometrii UC Davis, przy wsparciu technicznym Bridget McLaughlin, Jonathana Van Dyke'a i Ashley'a Karajeh, a także ze środków NCI P30 CA093373 (Comprehensive Cancer Center) oraz S10OD018223 (cytometr Beckman Coulter "Cytoflex").

1. Powlekanie HEK293T komórek w formacie 96-dołkowy
<ol>
	<li>W szafce na bezpieczeństwo biologiczne zbierz pojemnik na odpady wybielacze, pipety serologiczne, pipetę pipetową, solankę Dulbecco z buforem fosforanowym (DPBS), podłoże Dulbecco zmodyfikowane Eagle's Medium (DMEM) z 10% surowicy płodowej bydła (FBS) oraz kolbkę do hodowli komórek T-75 z mieszanką komórek HEK293T. Podgrzewanie podłoża do 37 °C.</li>
	<li>W kolbie T-75 sprawdź, czy zbieżność jest około 80%-100% zbiegająca się za pomocą odwróconego mikroskopu.</li>
	<li>W szafce biobezpieczeństwa użyj pipety serologicznej, aby aspirować zużyte podłoże z kolby do hodowli komórek. Unikaj dotykania powierzchni lub plastiku kolby. Zutylizuj zużyte materiały i aspirator do pojemnika na odpady.</li>
	<li>Delikatnie umyj komórki około 10 ml DPBS, wciągając go do rogu kolby i delikatnie mieszając wokół powierzchni. Zassaj DPBS z kolby i wyrzuć płukacz oraz aspirator do pojemnika na odpady.</li>
	<li>Dodaj 1,5 ml 0,05% trypsyny-EDTA, aby pokryć powierzchnię kolby i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 minutę. Delikatnie stuknij w kolbę, aby poluzować komórki z powierzchni.</li>
	<li>Dodaj 8,5 mL świeżego DMEM do kolby. Ponownie zawiesić i wymieszać komórki pipetą serologiczną, aż wszystkie agregaty zostaną rozbite przez aspirację w górę i w dół.</li>
	<li>Zbierz 9 mL zawiesiny ogniwowej do stożkowej rurki o pojemności 15 mL.<ol>
		<li>Dodaj 9 ml świeżego DMEM do kolby i umieść ją w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5%CO2</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą hemocytometru wymieszaj 10 μL zawieszonych komórek z 10 μL barwnika Trypana w proporcji 1:1, aby obliczyć stężenie komórek. Użyj tej wartości, aby przygotować wystarczającą liczbę komórek do zasiewania na płytce.</li>
	<li>Nasiać ~35 000 komórek w 100 μL dla każdej studni wysokowydajnej czarnej szklanej płyty dnej #1.5 z 96 dołkami i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5%CO2 przez 24 godziny.</li>
</ol>
2. Optymalizacja transfekcji 2pLACE
<ol>
	<li>Dla jednego dołku i 10% nadmiaru należy zapodać 11 μL ciepłego, wolnego od surowicy DMEM (SFM) do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.</li>
	<li>Stosując CRY2-eGFP: stosunki mas plazmidów CIBN-gRNA równe 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 i 9:1, aliquotują 110 ng dla każdego dołka całkowitego DNA do aliquotów SFM (Tabela 1).</li>
	<li>Jako kontrolę dodatnią, aliquotuj tę samą masę plazmidu CMV-eGFP do różnych aliquotów SFM.</li>
	<li>Dla każdego dołka należy zaznaczyć 11 μL SFM na rozcieńczenie odczynników transfekcyjnych.</li>
	<li>Przygotuj odczynnik transfekcyjny w stosunku masy (μg) do objętości (μL) DNA i reagenta transfekcyjnego.</li>
	<li>Dodaj rozcieńczony odczynnik transfekcyjny do rozcieńczonego DNA i inkubuj przez 12 minut w temperaturze pokojowej, aby uzyskać kompleksy transfekcyjne.</li>
	<li>Dodaj ~20 μL kompleksu transfekcyjnego do każdego dołku. Upewnij się, że nie dotyka ścian studni.</li>
	<li>Owiń talerz folią aluminiową i umieść w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5%CO2 na 24 godziny.</li>
</ol>
3. Aktywacja 2pLACE
<ol>
	<li>Zmodyfikuj kod wejściowy mikrokontrolera, aby oświetlać pożądane otwory za pomocą tych ustawień (Supplementary Coding File 1, linie 147 - 158).<ol>
		<li>Natężenie LED: 9,27 mW/cm2 (Plik kodowania uzupełniający 1, linie 200 - 215).</li>
		<li>Długość impulsu: 1 s (Plik kodujący uzupełniający 1, linie 280 - 290).</li>
		<li>Częstotliwość impulsów: 0,067 Hz (co 15 s) (Plik kodujący uzupełniający 1, linie 264 - 278). UWAGA: Ustawienia długości fali zależą od rodzaju zainstalowanych diod LED.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Spryskaj pokrywkę OptoPlate wydrukowaną w 3D 70% etanolem i pozwól wyschnąć w szafce z zabezpieczeniem biologicznym.</li>
	<li>Włącz lampę z ciemni z czerwonym światłem i umieść płytkę z 96 dołkami do szafki zabezpieczeń biologicznych, a pokrywkę zamień na wysuszoną pokrywkę wydrukowaną w 3D. UWAGA: Ogniwa CMV-eGFP można opcjonalnie obejrzeć za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby oszacować efektywność transfekcji.</li>
	<li>Weź płytę z 96 dołkami i umieść ją na matrycy LED, aby zbudować aparat LED. Upewnij się, że płytka zatrzasnęła się na miejscu.</li>
	<li>Podłącz mikrokontroler, diodę LED i porty wentylatora do źródła zasilania.</li>
	<li>Ostrożnie spryskaj przewody 70% etanolem i wytrzyj do sucha.</li>
	<li>Umieść aparat z matrycą LED w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5%CO2 na 24 godziny. Upewnij się, że diody LED świecą się zgodnie z przeznaczeniem i że przewody nie są napięte podczas uszczelniania inkubatora.</li>
</ol>
4. Przygotowanie cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>W środowisku czerwonych latarni wyjmij OptoPlate i umieść ją w szafce zabezpieczającej się biologicznie UWAGA: Komórki można opcjonalnie obejrzeć za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby wizualnie potwierdzić indukcję światła.</li>
	<li>Ostrożnie zasysaj wszystkie media z każdego dołku.</li>
	<li>Odłącz komórki za pomocą 30 μL 0,05% trypsyny-EDTA i inkubuj przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Każdą studnię mieszać z 100 μL zimnym buforem FACS (1% FBS w PBS) aż do pojedynczej komórki.</li>
	<li>Przełóż każdą próbkę na płytkę z 96 dołkami w kształcie litery V.</li>
	<li>Wiruj płytkę V-bottom z 96 dołkami w temperaturze 164 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Aspiruj 80 μL supernatantu bez naruszania granulki.</li>
	<li>Dodaj 200 μL zimnego bufora FACS, aby ponownie zawiesić pellet.</li>
	<li>Owiń płytkę V-bottom z 96 dołkami folią aluminiową dla lekkiej izolacji.</li>
	<li>Włóż talerz do styropianowego pudełka z lodem do transportu.</li>
</ol>
5. Bramkowanie i zbieranie danych cytometrią przepływową
<ol>
	<li>Włącz cytometr przepływowy za pomocą przełącznika z tyłu i otwórz odpowiednie oprogramowanie do cytometrii przepływowej na komputerze.</li>
	<li>Uruchom program startowy systemu i załaduję 2 mL wody DI do ładowarki próbek (Ilustracja uzupełniająca 1A).</li>
	<li>Uruchom kontrolę jakości (QC) z wykorzystaniem dostarczonych kulek QC (Ilustracja Uzupełniająca 1B).</li>
	<li>Upewnij się, że cytometr przepływowy jest w trybie pobierania próbek płytowych (Rysunek Uzupełniający 1C).</li>
	<li>Ustaw i określ studnie próbkowe (Rysunek Uzupełniający 1D).</li>
	<li>Stwórz następujące wykresy rozrzutowe i tabele (Rysunek uzupełniający 2A).<ol>
		<li>Rozpraszanie boczne (SSC-A) vs rozpraszanie w kierunku przodu (FSC-A).</li>
		<li>SSC-H kontra SSC-A.</li>
		<li>SSC-A kontra FITC-A.</li>
		<li>Tabela statystyk FITC-A (Rysunek Uzupełniający 2B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zatrzaskaj płytkę V-dolną do ładowarki płytowej cytometru.</li>
	<li>Wybierz nietransfektowany dół i kliknij Inicjalizuj, a następnie kliknij Uruchom. Upewnij się, że częstotliwość próbkowania objętości wynosi 10 μL/min (Ilustracja uzupełniająca 2C).</li>
	<li>Dostosuj napięcia SSC i FITC, aby skoncentrować populację zainteresowania na wykresie SSC-A vs FSC-A (Rysunek Uzupełniający 2C).<ol>
		<li>Stwórz wielokąt, aby zbudować populację zdrowych komórek zainteresowanych (Rysunek uzupełniający 2D).</li>
		<li>Stwórz wielokąt do bramki dla dyskryminacji podwójnej na wykresie SSC-H vs SSC-A.</li>
		<li>Dostosuj napięcie FITC, aby umieścić nietransfekowane ogniwa w lewej stronie wykresu SSC-A vs FITC-A (Ilustracja uzupełniająca 2D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz to dla pozostałych nieprzetworzonych odwiertów i zapisz dane Średniej FITC-A.</li>
	<li>Wybierz studnię CMV-eGFP przetransfektowaną i kliknij Uruchom.</li>
	<li>Dostosuj napięcie FITC, aby uchwycić zarówno ogniwa autofluorescencyjne, jak i fluorescujące na wykresie SSC-A vs FITC-A.<ol>
		<li>Stwórz wielokąt, który zbliża się do komórek fluorescencyjnych względem komórek niefluorescencyjnych, jednocześnie odwołując się do początkowej bramki w komórkach nietransfekowanych (Rysunek uzupełniający 2E).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Automatyczne nagrywanie próbek z prędkością 60 μL/min aż do osiągnięcia 200 sekund i/lub liczba zdarzeń do 10 000 (Rysunek uzupełniający 2F).</li>
	<li>Eksportuj Mean FITC jako plik CSV i analizuj dane.</li>
	<li>Wyczyść cytometr przepływowy przez opcję Daily Clean (Ilustracja uzupełniająca 2G).</li>
</ol>
6. Optymalizacja intensywności LED
<ol>
	<li>Edytuj skrypt mikrokontrolera, aby przetestować pożądane natężenia diod LED (Supplementary Coding File 1, linie 200-215). UWAGA: Równoważne natężenia LED względem wartości w skrypcie mikrokontrolera są podawane w innych miejscach38. Samokalibracja może być konieczna przy użyciu różnych diod LED.</li>
	<li>Upewnij się, że skrypt zawiera następujące wartości w (Supplementary Coding File 1, linie 200-215) zgodnie z Tabelą 2, i prześlij kod do mikrokontrolera.</li>
	<li>Powtórz kroki 1-5.</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.

Protokół ten demonstruje optogenetyczną kontrolę wieloskładnikowej ekspresji przejściowej genów w komórkach ssaków, umożliwiając innym badaczom szybkie i jednoczesne charakteryzowanie modułowych systemów optogenetycznych za pomocą fluorescencyjnego reportera.
W tym przypadku zoptymalizowano dwuplazmidowy system indukowalny światłem do ekspresji eGFP w HEK293T komórkach. Aby uzyskać skuteczną współtransfekcję, niezbędne jest optymalizacja gęstości siewu i stosunków mas dla maksymalnej efektywno...

Narzędzia biologii syntetycznej, takie jak systemy indukowalnej ekspresji genów, wniosły znaczący wkład w badania biologiczne. Ich zdolność do regulacji ekspresji genów w sposób dostosowalny, odwracalny i precyzyjny może poprawić kontrolę nad produkcją białek 1,2,3,4,5,6, morfologii komórek 7,8,9,10,11,12, szlaków metabolicznych 13,14,15,16,17,18 oraz inne cele do bioprodukcji i zastosowań terapeutycznych. Układy chemicznie indukowalne mogą mieć efekty resztkowe19,20 lub niecelowe. Dodatki chemiczne mogą być również bardzo drogie i trudne do skalowania przemysłowo ze względu na dodatkowe procesy oczyszczania w dalszej fazie 21,22,23. Systemy ekspresji genów indukowalne światłem mogą zaoferować skalowalną i precyzyjną metodę praktyk bioprodukcyjnych 24,25,26,27.
Wiele systemów ekspresji genów indukowanych światłem zostało opracowanych jako użyteczne narzędzia biologii syntetycznej w różnych zastosowaniach 28,29,30,31,32,33,34,35,36 oraz długości fal niebieskiego 35,37,38, czerwonego/dalekiego czerwonego12,39,40, czyli zielone światło41. W przypadku regulacji genów optogenetycznych opartych na CRISPR, modyfikacja liczby dostarczonych indywidualnych RNA przewodników (gRNA) może wpłynąć na ekspresję mRNA genów endogennych42 i będzie wymagała optymalizacji pod kątem różnych linii komórkowych. Można również stosować białka transaktywacyjne, takie jak VP64 37,42,43,44, VP16 39,40,44,45,46, p65 44 lub fuzjeich 47, zwiększając modułowość układów optogenetycznych. Aby zbadać złożone i splecione szlaki biologiczne 12,40,48,49,50,51,52,53, można testować różne kombinacje tych znanych składników. Dodatkowo, różne linie komórkowe mogą wykazywać różnice w indukcji z tym samym systemem52. Różne poziomy indukcji mogą prowadzić do niewystarczającej ekspresji genów lub czułości w precyzyjnej kontroli ekspresji genów, co wymaga rygorystycznych testów w celu znalezienia optymalnego systemu optogenetycznego w nowych lub bardziej biologicznie istotnych liniach komórkowych. Wraz z rosnącym tempem i poszerzaniem się zastosowań regulacji genów optogenetycznych, konieczne jest szybkie scharakteryzowanie tych różnych systemów.
Obecne metody charakteryzacji narzędzi optogenetycznych wykorzystują stabilną lub przejściową ekspresję genów12,54. Generowanie stabilnie wyrażających linie komórkowe i optymalizacja dynamiki systemu dla maksymalnej ekspresji mogą być czasochłonne, a przez to kosztowne. Ekspresja przejściowa umożliwia szybkie i cenne wnioski, zwłaszcza podczas testowania wieloskładnikowych systemów optogenetycznych. Tutaj zastosowaliśmy system efektora CRISPR-dCas9 (LACE)37 aktywowanego niebieskim światłem, składającego się z kryptochromu 2 (CRY2) oraz kryptochromu oddziałującego z podstawową helisową pętlą helisową helisy N-terminalem (CIBN). Stosowano go do kontroli ekspresji genów w komórkach ssaków, takich jak HEK293T (ludzkie komórki nerek embrionalnych)37,38, CHO-DG44 (komórki jajnika chomika chińskiego)55 oraz C2C12 (komórki myoblastu myszy)38. Jego modułowy charakter jest idealny do szybkiego charakteryzowania wydajności systemu za pomocą ekspresji przejściowych i metod o wysokiej przepustowości. Na przykład systemy wieloskładnikowe, takie jak LACE, mogą wymagać optymalizacji stosunków mas, aby poprawić indukcję, co jest krokiem rzadko stosowanym w charakteryzacji systemów optogenetycznych.
Protokół ten opisuje szybką optymalizację i charakterystykę systemu 2pLACE38 z dwoma plazmidami. W tym układzie 2pLACE kontroluje ekspresję fluorescencyjnego reportera, eGFP (wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego), w HEK293T komórkach. Aktywacja odbywa się na czarnych płytach 96-dołkowych z czarnym szklanym dnem za pomocą OptoPlate-96, drukowanej w 3D matrycy LED zaprojektowanej i zbudowanej przez Lukasza Bugaja i współpracowników56, 57, 58, 59. Protokół ten w szczególności optymalizuje maksymalną ekspresję przy różnych stosunkach mas układu dwuplazmidowego. Zawiera także przyjazny dla użytkownika kod do sterowania różnymi natężeniami światła, aby sprawdzić możliwość strojenia systemu i jego pełny zakres dynamiczny. Cytometria przepływowa jest stosowana do zbierania i analizy danych. Protokoły generowania konstrukcji plazmidowych i materiałów do druku 3D dla matrycy LED można znaleźć w poprzednich publikacjach 54,56. Metody te podkreślają szybki, wysokoprzepustowy proces charakteryzowania systemów ekspresji genów indukowanych światłem.

<table><tbody><tr><td>Rurki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 mL</td><td>VWR</td><td>10025-724</td><td></td></tr><tr><td>Zbiorniki odczynników 10 mL</td><td>VWR</td><td>77395-252</td><td></td></tr><tr><td>10 mL pipety serologiczne</td><td>VWR</td><td>75816-100</td><td></td></tr><tr><td>1000 i mu; Końcówki filtrów L</td><td>VWR</td><td>76322-154</td><td></td></tr><tr><td>15 mL&nbsp; Wysokowydajne rury wirówkowe, płaska pokrywa</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>Miernik mocy optycznej z 1931-C</td><td>Newport</td><td>1931-C</td><td></td></tr><tr><td>2 mL pipety serologiczne</td><td>VWR</td><td>75816-104</td><td></td></tr><tr><td>20 & mu; Końcówki filtrów L</td><td>VWR</td><td>76322-134</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; Końcówki filtrów L</td><td>VWR</td><td>76322-150</td><td></td></tr><tr><td>50 mL wysokowydajne rurki do wirówek z płaskim zakrętem</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Płyty V-bottom z 96 dołkami</td><td>BRANDplates</td><td>781661</td><td></td></tr><tr><td>A21, czerwona żarówka LED</td><td>Żarówki Bluex</td><td>Nie ma</td><td>Źródło czerwonego światła</td></tr><tr><td>Oprogramowanie IDE Arduino</td><td>Arduino</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Szafka Biosafety, klasa II</td><td>NuAire</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr jasnej linii</td><td>Hausser Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Slajdy liczące komórki</td><td>BioRad</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do hodowli komórek 96-dołek, szklana płyta dolna #1.5H</td><td>Cellvis</td><td>P96-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie CytExpert</td><td>Beckman Coulter</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX gotowy do użycia fluorosfer kontroli jakości na dzień</td><td>Beckman Coulter</td><td>C65719</td><td>4 stopnie; C</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy CytoFLEX-S (4 kanały fioletowe, 2 niebieskie, 4 żółtozielone, 3 czerwone)</td><td>Beckman Coulter</td><td>C09766</td><td></td></tr><tr><td>Fosforanowy puforowany proszek solny fizjologicznej Dulbecco, bez kaliku, bez magnezu</td><td>Fisher Scientific</td><td>21600069</td><td>Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>Wirówka Eppendorf 5804</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp; 022622501</td><td>Etap wirówki płyty V-bottom</td></tr><tr><td>Wirówka Eppendorf 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>22625501</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus, 8-kanałowy, zmienna objętość, 30 - 300 & mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>3125000052</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus, jednokanałowy, zmienna objętość, 100 - 1000 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus, jednokanałowy, zmienna głośność, 2 - 20 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus, jednokanałowy, zmienna objętość, 20 - 200 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>Taśma do etykietowania laboratoryjnego ogólnego przeznaczenia</td><td>VWR</td><td>89097-920</td><td></td></tr><tr><td>Gibco DMEM, proszek, wysoka glukoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>12100061</td><td>4 stopnie; C</td></tr><tr><td>Gibco Trypan Blue Solution, 0,4%</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-250-061</td><td>Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>Gibco Value Heat Inactivated FBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>A5256901</td><td>-20 &°C; C</td></tr><tr><td>Gibco, trypsyna-EDTA (0,05%), z EDTA, pochodzenie zwierzęce, 1X, Phenol Red, 500 mL</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td>-20 &°C; C</td></tr><tr><td>HEK293T Komórki</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>-80 &°; C, Ciekły azot</td></tr><tr><td>Markery laboratoryjne, mikronowa</td><td>VWR</td><td>89205-944</td><td></td></tr><tr><td>Metalowa lampa biurkowa</td><td>Proste projekty</td><td>Nie ma</td><td>Lampa na czerwone światło</td></tr><tr><td>OptoPlate-96</td><td>LABmaker</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-aid XP</td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid: CIBN-gRNA</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td>-20 &°C; C</td></tr><tr><td>Plazmid: CMV-eGFP</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td>-20 &°C; C</td></tr><tr><td>Plazmid: CRY2-eGFP</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td>-20 &°C; C</td></tr><tr><td>Reagent transfekcyjny in vitro DNA PolyJet</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1536117</td><td>4 stopnie; C</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórek T-75</td><td>VWR</td><td>10062-860</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2 z okładziną wodną</td><td>VWR</td><td>10810-884</td><td></td></tr></tbody></table>

szybka optymalizacja systemu indukowalnego światłem do kontroli ekspresji genów ssaków

Rapid Optimization of a Light-Inducible System to Control Mammalian Gene Expression

Narzędzia do indukowalnej ekspresji genów mogą otworzyć nowe zastosowania w zdrowiu ludzi i biotechnologii, ale obecne opcje są często kosztowne, trudne do odwrócenia i mają niepożądane, niecelne efekty. Systemy optogenetyczne wykorzystują białka reagujące na światło do kontrolowania aktywności regulatorów tak, że ekspresja jest kontrolowana za pomocą "przełącznika". Badanie to optymalizuje uproszczony system efektora CRISPR aktywowanego światłem (2pLACE), który zapewnia regulowaną, odwracalną i precyzyjną kontrolę ekspresji genów ssaków. OptoPlate-96 umożliwia wysokoprzepustowe przesiewanie za pomocą cytometrii przepływowej do analizy pojedynczych komórek oraz szybkiej optymalizacji 2pLACE. Badanie to pokazuje, jak wykorzystać system 2pLACE z OptoPlate-96 w komórkach HEK293T do identyfikacji optymalnych stosunków składowych maksymalizujących zakres dynamiczny oraz do znalezienia krzywej odpowiedzi intensywności niebieskiego światła. Podobne procesy można opracować dla innych komórek ssaków oraz dla innych systemów optogenetycznych i długości fal światła. Te postępy zwiększają precyzję, skalowalność i elastyczność narzędzi optogenetycznych do zastosowań bioprodukcyjnych.

Korzystając z elementów przepływu pracy z wcześniejszej literatury37, 38, 55, dodaliśmy jednoczesne oświetlenie o wysokiej przepustowości z OptoPlate-96 i zademonstrowaliśmy pipeline umożliwiający szybkie optymalizowanie systemu ekspresji genów indukowalnego światłem w komórkach ssaków (rysunek 1).
W systemach indukowalnej ekspresji genów wysokie zakresy dynamiczne są klu...

Badanie opisuje metodę eksperymentów o wysokiej przepustowości z wykorzystą matrycę LED drukowaną w 3D, aby zoptymalizować ekspresję genów indukowanych światłem w HEK293T komórkach.

Szybka optymalizacja systemu indukowalnego światłem do kontroli ekspresji genów ssaków

Inducible gene expression tools can open novel applications in human health and biotechnology, but current options are often expensive, difficult to ...

Projekt ten ma na celu opracowanie wysokoprzepustowej metody optymalizacji i charakteryzacji wieloskładnikowego narzędzia optogenetycznego o nazwie LACE do ekspresji genów ssaków. Na początek umieść kolbkę z komórkami HEK 293 T w szafce na zabezpieczenie biologiczne. Użyj pipety serologicznej do aspiracji zużytego nośnika.Pipetą nałóż 10 mililitrów DPBS do jednego rogu kolby i delikatnie mieszaj, aby umyć komórki. Następnie zasysaj roztwór płukający i wyrzucaj zarówno DPBS, jak i aspirator do pojemnika na odpady. Następnie dodaj do kolby 1,5 mililitra 0,05% trypsyny-EDTA, aby pokryć powierzchnię, i inkubuj.Delikatnie stuknij w kolbę, aby poluzować komórki z powierzchni. Następnie pipetować 8,5 mililitra świeżego DMEM do kolby. Aspiruj roztwór w górę i w dół, aż nie pojawią się żadne agregaty do ponownego zawiesienia komórek.Następnie przelej dziewięć mililitrów zawiesiny ogniwowej do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Dodaj do kolby dziewięć mililitrów świeżego DMEM. Inkubuj zawiesinę aż do zbiórki pod 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Teraz wymieszaj 10 mikrolitrów zawieszonych komórek z 10 mikrolitrami barwnika trypsyny w proporcji jeden do jednego, aby obliczyć stężenie komórek za pomocą hemocytometru. Do każdego odwiertu zasiać około 35 000 komórek w 100 mikrolitrach wysokiej wydajnej płyty o wysokiej wydajności numer 1,5, czarnej, 96-dołkowej płyty o szklanym dnie. Włóż talerz do inkubatora ustawionego na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 24 godziny.Do transfekcji najpierw należy podać 11 mikrolitrów ciepłego, wolnego od surowicy DMEM do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra na jeden dołek i nadmiar 10%. Przygotuj różne stosunki masowe plazmidów białka fluorescencyjnego wzmocnionego CRY2 do RNA przewodnika CIBN/Aliquot 110 nanogramów na dołek przygotowanych roztworów do każdej probówki zawierającej alikwoty medium wolnego od surowicy. Następnie pipetuję dodatkowe 11 mikrolitrów bezsurowicznego DMEM dla każdego dołka do osobnych probówek do rozcieńczenia odczynników transfekcyjnych.Dodaj rozcieńczony odczynnik transfekcyjny do mieszaniny podłoża DNA i inkubuj, aby utworzyć kompleksy transfekcyjne. Następnie pipetować 20 mikrolitrów przygotowanego kompleksu transfekcyjnego do każdej dołki na 96-dołkowej płytce zawierającej komórki HEK 293 T. Owiń płytę z 96 dołkami folią aluminiową i umieść ją w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza pod stężeniem 5% dwutlenku węgla na 24 godziny.Aby rozpocząć proces aktywacji, zmodyfikuj kod wejściowy mikrokontrolera, aby oświetlał pożądane studnie za pomocą określonych linii skryptu. Ustaw natężenie diody lulumenckiej na 9,27 miliwata na centymetr kwadratowy, korzystając z wskazanych linii kodowych. Reguluj długość impulsu do jednej sekundy, a następnie ustaw częstotliwość na 0,067 herca, co odpowiada co 15 sekund.Spryskaj pokrywkę optoPlate wydrukowaną w 3D 70% etanolem. Następnie pozwól wyschnąć w szafce zabezpieczającej się biologicznie. Teraz włącz czerwoną lampę w ciemni.Włóż płytkę z 96 dołkami do szafki do zabezpieczenia biologicznego. Wymień pokrywkę talerza na wysuszoną pokrywkę drukowaną w 3D. Umieść płytkę z 96 dołkami na matrycy LED, aby złożyć aparat aktywacyjny.Umieść w pełni złożony aparat LED w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 24 godziny. Podłącz mikrokontroler, diodę lutarną i porty wentylatora do źródła zasilania. Aby wykonać cytometrię przepływową, uruchom program uruchamiający system w oprogramowaniu ekspertów na stronie.Załaduj dwa mililitry wody zdejonizowanej do ładowarki próbek. Przeprowadz kontrolę jakości z wykorzystaniem dostarczonych koralików kontroli jakości. Ustaw i określ odwierty próbkowe do pozyskiwania.Stwórz wykresy i tabele dla rozrzutu bocznego względem rozrzutu do przodu, wysokości rozrzutu bocznego względem obszaru bocznego, obszaru rozpraszania bocznego względem FITC-A oraz tabeli statystyk FITC-A. Teraz zatrzaskaj płytkę V-down 960-dołkową do ładowarki płytowej cytometru. Wybierz nietransfektowany dół i kliknij Inicjalizuj, a następnie Uruchom.Dostosuj rozpraszanie boczne i napięcia FITC, aby centrować populację zainteresowaną na wykresie SSC-A kontra FSC-A. Kliknij na Run, a następnie wybierz zielone fluorescencyjne białko wzmocnione CMV, które zostało dobrze przetransekowane. Dostosuj napięcie FITC, aby uwzględnić zarówno ogniwa autofluorescencyjne, jak i fluorescencyjne w wykresie SSC-A kontra FITC-A.Stwórz wielokąt, aby zredukować populację zdrowych komórek. Drugi wielokąt do zabezpieczenia dla rozróżniania podwójnych na wykresie SSC-H kontra SSC-A. Stwórz bramkę wielokątną, aby odróżnić komórki fluorescujące od niefluorescencyjnych, używając bramki z komórek nietransfekowanych jako odniesienia.Automatyczne rejestrowanie próbek z prędkością 60 mikrolitrów na minutę, aż do upływu 200 sekund lub osiągnięcia 10 000 zdarzeń. Następnie eksportuj średnie wartości FITC jako plik CSV i analizuj dane. Czyść przepływowy cytometr, wybierając opcję codziennego czyszczenia.Obrazowanie fluorescencyjne wykazało, że przy stosunku masowym aktywacji niebieskiego światła jeden do dziewięciu indukuje się niższa maksymalna ekspresja eGFP w porównaniu do stosunku pięć, który również wykazywał zwiększoną nieszczelność w warunkach ciemności. Cytometria przepływowa wykazała, że ponad 95% zdarzeń gateated w P1 to singlety we wszystkich warunkach. A nietransfekowane komórki miały mniej niż 0,1% populacji z eGFP.Kontrola CMV-eGFP miała około 99% komórek eGFP-dodatnich, podczas gdy komórki transfekowane 2pLACE miały około 57%. Komórki transfekowane CMV-eGFP wykazywały silną konstytutywną ekspresję eGFP zarówno w jasnych, jak i ciemnych warunkach, podczas gdy komórki nietransfekowane nie wykazywały widocznej fluorescencji. Potwierdził również skuteczną transfekcję 2pLACE oraz aktywację ekspresji eGFP pod niebieskim światłem przy niższej ekspresji niż CMVeGFP. W próbkach 2pLACE aktywowanych światłem zaobserwowano trzykrotny wzrost ekspresji eGFP w porównaniu do warunków ciemności.Procent komórek eGFP-dodatnich w próbkach transfekowanych 2pLACE wynosił około 60%. Stosunek masy 3 do 7 dawał najwyższą średnią intensywność fluorescencji i zakres dynamiczny. Protokół ten umożliwia wysokoprzepustową ocenę próbek oraz techniczne replikowanie za pomocą optoPlate do programowania zmiennych warunków świetlnych i częstotliwości impulsów.

rapid-optimization-light-inducible-system-to-control-mammalian-gene

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Ten film demonstruje system ekspresji genów tetracykliny lub Tet-On w modelu mysim. W obecności doksycykliny, pochodnej tetracykliny, system Tet-On składający się z białka transaktywatora kontrolowanego przez odwróconą tetracyklinę ulega aktywacji i ulega ekspresji interesującego genu.

Indukowalna regulacyjna ekspresja genów oparta na systemie Tet-On in vivo: indukowany tetracykliną system ekspresji genów do aktywacji transkrypcji genu docelowego w modelu mysim

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę szybkiej budowy sztucznych czynników transkrypcyjnych (ATF) z pokrewnymi reporterami GFP oraz ilościowe określenie zdolności ATF do stymulowania ekspresji GFP za pomocą cytometrii przepływowej.

Szybka synteza i badania przesiewowe chemicznie aktywowanych czynników transkrypcyjnych za pomocą reporterów opartych na GFP

Opisana tutaj metoda jest używana do indukowania kaskady sygnalizacji apoptotycznej na określonych etapach w celu zbadania aktywności antyapoptotycznego bakteryjnego białka efektorowego. Metoda ta może być również stosowana do indukowalnej ekspresji białek proapoptotycznych lub toksycznych lub do analizowania interferencji z innymi szlakami sygnałowymi.

Zastosowanie indukowalnego systemu ekspresji do badania interferencji bakteryjnych czynników wirulencji z sygnalizacją wewnątrzkomórkową

Ten protokół opisuje strategię optogenetyczną do modulowania aktywności kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus. Metoda ta pozwala na odwracalną aktywację szlaku sygnałowego MAPK w hodowli komórek ssaków oraz w wielokomórkowych organizmach żywych, takich jak zarodki Xendopus, z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Odwracalna modulacja szlaku kinazy białkowej aktywowanej mitogenem za pośrednictwem światła podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus

Tutaj prezentujemy protokół do analizy transferu informacji oscylacyjnych między komórkami za pomocą kontroli optogenetycznej i monitorowania ekspresji genów na żywo. Podejście to stanowi unikalną platformę do testowania funkcjonalnego znaczenia programów dynamicznej ekspresji genów w systemach wielokomórkowych.

Metoda optogenetyczna do kontroli i analizy wzorców ekspresji genów w interakcjach międzykomórkowych

Ten protokół przedstawia kroki potrzebne do wygenerowania modelowego systemu, w którym transkrypcja interesującego nas endogennego genu może być warunkowo kontrolowana u żywych zwierząt lub komórek za pomocą ulepszonych systemów represora lac i/lub aktywatora tet.

Zastosowanie in vivo systemu REMOTE-control do manipulacji endogenną ekspresją genów

Niezawodna kontrola komórek ssaków reagujących na światło wymaga standaryzacji metod optogenetycznych. Aby osiągnąć ten cel, badanie to nakreśla linię budowy obwodów genowych, inżynierii komórkowej, obsługi sprzętu optogenetycznego i testów weryfikacyjnych w celu standaryzacji badania ekspresji genów indukowanej światłem przy użyciu optogenetycznego obwodu genowego o ujemnym sprzężeniu zwrotnym jako studium przypadku.

Niezawodna inżynieria i kontrola stabilnych optogenetycznych obwodów genowych w komórkach ssaków

Optogenetyka to potężne narzędzie o szerokim zastosowaniu. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób osiągnąć indukowaną światłem ekspresję genów w zarodkach danio pręgowanego przy użyciu reagującego na niebieskie światło systemu TAEL/C120.

Indukowana światłem ekspresja GFP w zarodkach danio pręgowanego przy użyciu optogenetycznego systemu TAEL/C120

Bioluminescencja - światło emitowane przez enzym lucyferazy utleniający substrat o małych cząsteczkach, lucyferynę - może być wykorzystane do aktywacji białek fotosensorycznych, dodając w ten sposób kolejny wymiar do stymulacji świetlnej i umożliwiając manipulowanie wieloma funkcjami zależnymi od światła w komórkach w skalach czasowych i przestrzennych.

Optogenetyka bioluminescencyjna 2.0: wykorzystanie bioluminescencji do aktywacji białek fotosensorycznych in vitro i in vivo

Optogenetyczna kontrola metabolizmu mikrobiologicznego oferuje elastyczną dynamiczną kontrolę nad procesami fermentacji. Niniejszy protokół pokazuje, jak skonfigurować fermentację regulowaną niebieskim światłem do produkcji chemicznej i białkowej w różnych skalach objętościowych.

Fermentacja kontrolowana światłem do produkcji mikrobiologicznej, chemicznej i białkowej

Ten protokół opisuje zastosowanie zaprojektowanej domeny przełącznika allosterycznego aktywowanego niebieskim światłem (LightR) do odwracalnej czasoprzestrzennej kontroli aktywności białek. Wykorzystując kinazę tyrozynową Src jako model, badanie to oferuje skomplikowany protokół do opracowania i scharakteryzowania regulowanego światłem Src (LightR-Src). Pokazuje to wszechstronność tego podejścia w różnych klasach enzymów.

Czasoprzestrzenna kontrola aktywności białek poprzez optogenetyczną regulację allosteryczną

Poznaj metodę optymalizacji ekspresji genów indukowanej światłem w komórkach HEK293T przy użyciu narzędzia optogenetycznego LACE i drukowanej w 3D matrycy LED.

Szybka optymalizacja systemu indukowalnego światłem do kontroli ekspresji genów ssaków

Przeglądaj więcej filmów